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  • 貓冠狀病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

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    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目錄號 : TW39648
    • 應用 : 僅供科研使用
    • 保存條件 : 低溫/避光保存
    • 貨期 : 現(xiàn)貨
    • 商品庫存：100
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產(chǎn)品及特點：
貓冠狀病毒(Feline Coronavirus，F(xiàn)CoV)是一種RNA病毒，可引起病毒血癥，貓冠狀病毒感染在貓群體當中是非常普遍的，大約有20%~60%的寵物貓可以檢測到這種抗體的存在。而且對于部分喂養(yǎng)了多只寵物貓的家庭，有時抗體陽性率可達100%，具有高度傳染性，主要通過糞便及消化道途徑傳播。貓冠狀病毒感染是貓的多發(fā)病，發(fā)病率高，死亡率低，因此貓冠狀病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。
1. 一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。
2. 根據(jù)貓冠狀病毒的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達到至少 1000 拷貝/反應。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。
規(guī)格及成分：

編號

成分

規(guī)格

試劑一

2×qRT-PCR 緩沖液

500 μL(棕色管)

試劑二

10×qRT-PCR 酶混合液

100 μL(紅蓋)

試劑三

ROX 染料 I，50×

20 μL(棕色管)

試劑四

ROX 染料 II，50×

20 μL(棕色管)

試劑五

熒光 PCR 專用模板稀釋液

1mL(黃蓋)

試劑六

貓冠狀病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液

100 μL(白蓋)

試劑七

貓冠狀病毒染料法 qRT-PCR 陽性對照 (1×10E8 /μL)

50 μL(黃蓋)

試劑八

沙核酸釋放劑(試用裝)

20 次(1mL，綠蓋)

試劑九

使用手冊

1 份

運輸及保存：
低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 DNA 片段作為陽性對照。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法：  
一、稀釋陽性對照： 
以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例，由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同)。
2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備：  
5. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照)，一個是 NC(樣品制備陰性對照)?？梢杂?10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。
6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三、設置RT-PCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）：
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板)，1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號陽性對照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個標曲反應縮減成 1 個，其余不變。
8. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加)：

成分

N+2個制備

所得樣品

qRT-PCR

陰性對照

qRT-PCR陽性對照(2-7管)

2×qRT-PCR緩沖液

10μL

10μL

各10μL

貓冠狀病毒染料法qRT-PCR引物混合物

2μL

2μL

各2μL

50×ROX (見注)

0.4μL

0.4μL

各0.4μL

樣品制備所得RNA

模板(來于第8步)

5.6μL

--

--

稀釋所得6個陽性對照 (來于第6步)

--

--

各5.6μL2號樣到2號 管,3號樣到3號管

超純水

--

5.6μL

--

10×qRT-PCR酶混合液

2μL

2μL

2μL

注： 需使用 ROX 染料 I 的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的機型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的機型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上機后按下面參數(shù)進行 RT-PCR(參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化)。

過程

溫度

時間

RT（逆轉(zhuǎn)錄）

50℃

15-30 min

預變性

95℃

5 min

Qrt-PCR反應40個循環(huán)

95℃

15 sec

58℃

1 min,（采集FAM通道的熒光信號）

按儀器預設程序進行溶解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理：
10. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！