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試劑盒實(shí)驗(yàn)操作視頻

試劑盒實(shí)驗(yàn)視頻操作


  實(shí)驗(yàn)步驟：


  1. 樣品準(zhǔn)備

  裂解液（RIPA）準(zhǔn)備-----每100 ul RIPA加入1 ul PMSF和1 ul的原釩酸鈉溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。加入PMSF，加入原釩酸鈉溶液。

  組織樣本-----黃豆大小組織剪碎，加入200-300 ul配備好的裂解液，冰上研磨，12000轉(zhuǎn)離心5 min，取上清。

  貼壁細(xì)胞-----6孔板一個(gè)孔長(zhǎng)滿，加150 ul配備好的裂解液，冰上裂解5-10 min，槍頭吹打，吸取裂解好的樣本，轉(zhuǎn)入EP管，12000轉(zhuǎn)離心5 min，取上清。

  懸浮細(xì)胞-----細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管，2000轉(zhuǎn)離心5 min，棄上清，加入PBS清洗，2000轉(zhuǎn)離心5 min，棄上清，每20 ul體系細(xì)胞加入150 ul裂解液，冰上裂解5-10 min，槍頭吹打充分裂解，12000轉(zhuǎn)離心5 min，取上清。

  2. 蛋白濃度測(cè)定

  標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

  待檢樣本上樣

  加入顯色劑，室溫避光20-30 min

  酶標(biāo)儀測(cè)定OD值

  計(jì)算蛋白上樣量（建議每樣本上樣總蛋白含量為50 μg）

  3. 樣本變性

  每40 μL蛋白，加10 ul的5XSDS 上樣緩沖液

  沸水浴10 min

  -20℃保存

  4. SDS-PAGE膠制備

  灌入分離膠

  無水乙醇?jí)浩?br />
  分離膠完全聚合后，倒出無水乙醇

  雙蒸水沖洗

  濾紙吸干

  加入濃縮膠

  插上梳齒

  濃縮膠完全聚合后取出梳齒

  5. 電泳

  膠固定到電泳槽

  倒入電泳液

  加樣，加marker,

  電泳----80 V恒壓至溴酚藍(lán)到濃縮膠與分離膠交界處，改110 V恒壓至溴酚藍(lán)到凝膠底部