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品質保證 · 通蔚試劑

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  • 甲型流感(禽流感)病毒H5N1亞型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

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    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目錄號 : TW39553
    • 應用 : 僅供科研使用
    • 保存條件 : 低溫/避光保存
    • 貨期 : 現(xiàn)貨
    • 商品庫存:100
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產品及特點:
H5N1 是甲型流感(禽流感)病毒的一種亞型,為 RNA 病毒。流感病毒顆粒外膜由兩型表面糖蛋白覆蓋,一型為植物血凝素(即 H),一型為神經氨酸酶(即N),H 又分 16 個亞型,N 分 9 個亞型。所有人類的流感病毒都可以引起禽類流感,但不是所有的禽流感病毒都可以引起人類流感, 現(xiàn)在已經確認能夠感染人的禽流感病毒共有 8 種,包括 H5N1、H5N2、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N7,以及最近的 H7N9。禽類流感根據其致病性可分為高致病性和低致病性,H5N1 為高致病性禽流感病毒。本產品以探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測甲型流感病毒 H5N1 的試劑盒,它具有下列特點:
1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2. 引物和探針經過優(yōu)化,靈敏性高。
3. 提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高,引物是根據甲型流感(禽流感)病毒H5N1亞型高度保守區(qū)設計,不會跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。
6. 本產品只能用于科研。
規(guī)格及成分:

編號

成分

規(guī)格

試劑一

探針法 qRT-PCR 緩沖液

500 μL(藍蓋)

試劑二

探針法 qRT-PCR 酶混合液

100 μL(紅蓋)

試劑三

熒光 PCR 專用模板稀釋液

1 mL(黃蓋)

試劑四

甲型流感(禽流感)病毒H5N1亞型探針法qRT-PCR引物混合液

100 μL(白蓋)

試劑五

甲型流感(禽流感)病毒H5N1亞型qRT-PCR 探針

50 μL(棕色管)

試劑六

甲型流感(禽流感)病毒H5N1亞型探針法qRT-PCR陽性對照(1×10E8 /μL)

50 μL(黃蓋)

使用手冊

1 份

運輸及保存:
低溫運輸、-20℃保存,有效期一年。
自備試劑:
樣品 RNA。
使用方法:
一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例):
由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備:
7. 如果有 N 個樣品,最好設置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 RNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反應(20μL 體系,在樣品制備室進行):
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復,則標記 N+4 個 PCR管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):

成份

樣品管

N+2個

RT-PCR

陰性對照管

標準曲線樣品管2-7管

探針法 qRT-PCR 緩沖液

各 10 μL

10 μL

各 10 μL

探針法 qRT-PCR 酶混合液

各 2 μL

2 μL

各 2 μL

甲型流感(禽流感)病毒H5N1

亞型qRT-PCR 探針

各 1 μL

1 μL

各 1 μL

甲型流感(禽流感)病毒H5N1亞型

探針qRT-PCR引物混合液

各 2 μL

2 μL

各 2 μL

待測樣品 RNA 模板

各 5 μL

--

--

超純水

--

5 μL

--

第7步所得標準曲線樣品稀釋液2-7號

不加

不加

各5 μL (2號樣到2號管,3號樣到3號管)

11. 蓋上蓋子后上機,按下面參數進行 qRT-PCR:

過程

溫度

時間

逆轉錄

50℃

30 min

預變性

94℃

10 min

qRT-PCR反應35個循環(huán)

94℃

15 sec

60℃

1 min,(采集FAM通道的熒光信號)

四、數據處理:
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 40,則為陽性。
五、特別提示:
本公司的所有產品,僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!