ELISA試劑盒操作要點

  大部分ELISA 檢測均以血清為標本。血清標本可按常規(guī)方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP 為標記的ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應。一般說來，在5 天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。過一周測定的需－20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。
  
  操作步驟
  
  （一）樣品準備
  
  1.取動物全血按常規(guī)方法制備血清，要求血清清亮，無溶血、無污染。樣品1周內(nèi)可于2～8℃保存，長期需置-20℃保存。
  
  2.用樣品稀釋液將待檢血清按100倍稀釋（如2μl血清加入198μl樣品稀釋液中，混勻）。陰、陽性對照不用稀釋。
  
  3.濃縮洗滌液使用前應恢復至室溫使沉淀溶解，然后用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋。
  
  （二）檢驗方法
  
  1.使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復至室溫。
  
  2.取所需用量酶標板條，設(shè)空白對照1孔、陰性/陽性對照各2孔，未用的板條盡快密封，2～8℃保存。
  
  3.空白對照孔加樣品稀釋液100μl；陰、陽性對照孔分別加入陰、陽性對照100μl；樣品孔每孔加入稀釋后的樣品100μl。
  
  4.混勻，置37℃反應30分鐘。
  
  5.扣去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，重復洗滌5次，拍干。
  
  6.每孔加酶標記物100μl（空白孔除外）。置37℃反應30分鐘。
  
  7.洗滌，同步驟5。
  
  8.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混勻，37℃避光反應10分鐘。
  
  9.每孔加終止液50μl，混勻，用空白孔調(diào)零，于450nm(可用630nm作參比波長）測定各孔吸光值（A值）。