【通蔚生物】：禽肺病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒產(chǎn)品特點及使用方法

通蔚生物禽肺病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒產(chǎn)品特點及使用方法如下：

產(chǎn)品及特點：
禽肺病毒(AvianPneumovirus，APV)會引起禽肺病毒感染，雞和火雞是本病的自然宿主，雉雞、珍珠雞和鵪鶉可被感染。該病毒主要經(jīng)接觸傳播，病禽及康復禽是主要傳染源。幼齡雞感染后臨床癥狀：氣管鑼音，打噴嚏，流鼻液，泡沫性結膜炎，眶下竇腫脹和頸下水腫，嚴重者咳嗽、甩頭。蛋雞感染后臨床癥狀：種雞和產(chǎn)蛋雞通常在產(chǎn)蛋高峰期發(fā)病，產(chǎn)蛋量下降5%-30%，有時下降70%，嚴重者導致輸卵管的脫垂；雞蛋皮薄、粗糙，種蛋孵化率降低。該病毒對養(yǎng)雞業(yè)會造成較大的經(jīng)濟損失，因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。
1.一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。
2.根據(jù)禽肺病毒的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性。
3.基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達到至少1000拷貝/反應。
4.使用一管式qRT-PCR技術，RT和PCR兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR。
運輸及保存：
低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供DNA片段作為陽性對照。
自備試劑：
樣品RNA。
使用方法：
一、稀釋陽性對照：
以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例，由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原。
1.標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同)。
2.在7號管中加入5μL1×10E8拷貝/μL的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
3.換槍頭，在6號管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
4.換槍頭，在5號管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備：
5.如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC(樣品制備陽性對照)，一個是NC(樣品制備陰性對照)?？梢杂?0μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號(濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。
6.用自選方法純化N+2個樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。
三、設置RT-PCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）：
7.如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照(用水做模板)，1個用于PCR陽性對照(用第4號陽性對照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標曲反應縮減成1個，其余不變。
8.在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加)：
注：需使用ROX染料I的機型：ABIPrism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-OnePlus。
需使用ROX染料II的機型：ABIPrism7500、7500Fast、MJResearch的Chromo4、Opticon(II)CorbettRotorGene3000。
不需要使用ROX的機型：ThermalCycleDiceRealTimeSystem，LightCycler、SmartCyclerSystem、AgilentMx3000P、RotorGene3000、RotorGene6000。
9.上機后按下面參數(shù)進行RT-PCR(參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化)。
四、數(shù)據(jù)處理：
10.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
11.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
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