【通蔚生物】：酸性蛋白酶(ACP)測(cè)試盒測(cè)定意義

通蔚生物酸性蛋白酶(ACP)測(cè)試盒測(cè)定意義如下：

ACP 是一種在酸性環(huán)境下催化蛋白質(zhì)水解的酶。該酶主要用于酒精發(fā)酵、啤酒釀造、毛皮軟化、果酒澄清、
醬油釀造、飼料等。
測(cè)定原理：
酸性條件下，ACP 催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍(lán)；鎢藍(lán)
在 680nm 有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定其吸光度增加，來(lái)計(jì)算 ACP 活性。
自備儀器和樣品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1mL 玻璃比色皿、1.5 mL EP 管和蒸餾水。
試劑組成和配置：
液體一：1.5mL×1 支，4℃保存。
液體二：1mL×1 支，4℃保存。
試劑一的配制：臨用前按液體一：液體二：蒸餾水=76（μL）：17（μL）：18（mL）的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)
用，如出現(xiàn)白色絮狀沉淀則不能用。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 10 mL 蒸餾水溶解。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 20 mL 試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。（可在燒杯上蓋一
層保鮮膜，注意觀察，避免水分全部蒸發(fā)，一般加熱 15-30 分鐘，該試劑為過(guò)飽和試劑，充分混勻后仍出
現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用）。
試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 50 mL 蒸餾水溶解。
試劑五：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支，0.25 μ mol/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，4℃保存。
粗酶液提?。?br /> 1. 試劑一的配制：見(jiàn)試劑的組成和配制。
2. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 試
劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心 10min，取上清，即粗酶液。
3. 血清或培養(yǎng)液：直接測(cè)定。
4. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞
加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后
8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定操作：
1.分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 680 nm，蒸餾水調(diào)零。
2.試劑二、試劑三和試劑四置于 30℃水浴保溫 30min。
3. 對(duì)照管：取一支 EP 管，加入 100μL 粗酶液，200μL 試劑二，混勻后置于 30℃水浴保溫 10min；加入 200μL
試劑三，混勻后 8000g， 4℃離心 10min；取 200μL 上清液，加入新的 EP 管，再加入 1000μL 試劑四，200μL
試劑五，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min，于 680nm 測(cè)定光吸收，記為 A 對(duì)照管。
4. 測(cè)定管：取一支 EP 管，加入 100μL 粗酶液，200μL 試劑三，混勻后置于 30℃水浴保溫 10min；加入 200μL
試劑二，混勻后 8000g， 4℃離心 10min；取 200μL 上清液，加入新的 EP 管，再加入 1000μL 試劑四，200μL
試劑五，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min，于 680nm 測(cè)定光吸收，記為 A 測(cè)定管。（注意與空白管不同，
先加試劑三，后加試劑二）
5. 空白管：取 EP 管，加入 200μL 蒸餾水，1000μL 試劑四，200μL 試劑五，混勻后置于 30℃水浴保溫
20min，于 680nm 測(cè)定光吸收，記為 A 空白管。
6. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 EP 管，加入 200μL 標(biāo)準(zhǔn)品，1000μL 試劑四，200μL 試劑五，混勻后置于 30℃水浴保溫
20min，于 680nm 測(cè)定光吸收，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。
注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。
ACP 活性計(jì)算公式：
1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算
ACP 活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生 1nmol 酪氨酸為 1 個(gè)酶活單位。
ACP 活性（nmol/min /mg prot）= C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×V 反總
÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
ACP 活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1 nmol 酪氨酸為 1 個(gè)酶活單位。
ACP 活性（nmol/min /g 鮮重）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×V 反總÷
（W×V1÷V2）÷T= 125×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）÷W
3. 按照液體體積計(jì)算
ACP 活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1nmol 酪氨酸為 1 個(gè)酶活單位。
ACP 活性（nmol/min/mL）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×V 反總÷V1÷T=
125×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）
1. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
ACP 活性單位定義：30℃每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生 1nmol 酪氨酸為 1 個(gè)酶活單位。
ACP 活性（nmol/min /104 cell）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×V 反總÷
（細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 125×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）÷細(xì)胞數(shù)量
C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.25 μ mol/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液；V 反總：酶促反應(yīng)總體積，0.5mL；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度
（mg/mL）；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），0.1 mL；V2：提取液總體積（mL），1mL；T：催化
反應(yīng)時(shí)間（min），10min；W：樣品質(zhì)量（g）。
注意事項(xiàng)：
1.試劑一按操作指示配制，用多少配多少，出現(xiàn)白色絮狀沉淀則不能用。
2.臨用前配制的試劑配置好后 3 天內(nèi)使用完畢。
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