ELISA實驗操作要點：固體樣本處理方法

固體樣本處理方法：

固體樣本處理原則：稱取1g的固體樣本，用9g的合適緩沖液溶解，分泌蛋白可以直接離心取上清檢測，細胞內(nèi)的蛋白，要先收集細胞，再用合適方法破碎，離心取上清測試。

1、組織標本：
2、切割標本后，稱取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。對于植物組織，不好勻漿的話，就用液氮研磨，將植物組織放在研缽中，加入適量液氮，充分研磨。

2、細胞內(nèi)蛋白樣本：
許多待測蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細胞內(nèi)的蛋白，這個時候，要先收集細胞，洗滌干凈，再破碎細胞，離心取上清。

（1）培養(yǎng)的細胞
A、動物細胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液，使細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融（如果反復(fù)凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎），以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
B、植物細胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液，使細胞濃度達到100萬/ml左右，置于冰盒上，用超聲破碎儀，設(shè)置破碎2s，冷卻30s的方式，充分破碎細胞，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

（2）組織的細胞
切割標本后，稱取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細胞三遍。再用上述的細胞破碎方法破碎細胞。

3、土壤：稱取1g土壤，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工將標本充分混勻。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。如果是測分泌蛋白，直接取上清檢測，測試細胞內(nèi)蛋白，要破碎細胞。

4、咽拭子：加入2g的pH7.2-7.4左右的PBS，溶解咽拭子頭部，搖勻，用鑷子取出咽拭子并擠干液體，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。如果是測分泌蛋白，直接取上清檢測，測試細胞內(nèi)蛋白，要破碎細胞。

5、植物標本的采集及保存
1、 稱取0.1g（誤差±3%以內(nèi)）新鮮植物組織樣本，在液氮中充分研磨；
2、 加入1ml的提取液（80%甲醇）, 置于-20度過夜；
3、 于4度，8000rpm，離心1小時，取上清；
4、 上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟是： 80%甲醇（1ml）平衡柱→上樣→收集樣品→移開樣品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循環(huán)。過柱后的樣本真空干燥或氮氣吹干，保存?zhèn)溆茫?/span>
5、 上樣前加入pH7.4 PBS緩沖液（1ml定容）?；靹蚝笫覝胤胖?0分鐘，然后4度離心（8000rpm，15分鐘），取上清并暫時保存于4度待用。

樣本收集注意事項
1、不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
2、標本采集后盡快進行實驗，若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。