021-54845833/15800441009品質(zhì)保證 · 通蔚試劑
發(fā)布時(shí)間：2024-09-14 發(fā)布作者：上海通蔚生物
ELISA實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，易于標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化，不過難免也會(huì)出現(xiàn)一些問題。常見問題包括標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳、無信號(hào)、變異系數(shù)（CV）及背景高問題。這些問題將會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文針對(duì)這些問題，為大家詳細(xì)的介紹。
目錄：
1）標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳
2）無信號(hào)
3）變異系數(shù)（CV）高
4）背景高
常見問題
解決方案
1.標(biāo)準(zhǔn)溶液不正確：使用錯(cuò)誤濃度的標(biāo)準(zhǔn)起始溶液可能會(huì)導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)稀釋不足或過度稀釋，從而導(dǎo)致 OD 偏差并使標(biāo)準(zhǔn)曲線超出范圍。
仔細(xì)檢查標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度、稀釋計(jì)算和稀釋度。如果您要從凍干小瓶中重構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)品，請(qǐng)確保遵循廠家的說明。建議渦旋小瓶以確保完全重構(gòu)。
2.降解標(biāo)準(zhǔn)：舊的或儲(chǔ)存不當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)可能已經(jīng)降解，導(dǎo)致 OD 值低于未降解的標(biāo)準(zhǔn)。
驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)是否已正確配制并適當(dāng)存儲(chǔ)。
3.曲線不符合比例：有時(shí)，即使您認(rèn)為曲線繪制正確，您仍可能觀察到比平時(shí)更高或更低的 OD 值。這可能是由于檢測(cè)試劑批次不同等因素導(dǎo)致吸光度變化。
首次使用特定廠家的 ELISA 試劑盒時(shí)，請(qǐng)確保使用推薦的曲線擬合模型，通常是 4 或 5 參數(shù)邏輯曲線擬合模型 (4-PL 或 5-PL)。如有必要，請(qǐng)嘗試其他曲線擬合模型，如對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)。一致性是關(guān)鍵，因此更改曲線擬合模型可能會(huì)導(dǎo)致您的結(jié)果在檢測(cè)之間無法比較，尤其是在需要絕對(duì)值的情況下。
4.移液誤差：向板中添加樣品時(shí)可能會(huì)發(fā)生移液誤差，例如樣品量不正確或變異系數(shù) (CV) 過高。
為了最大限度地減少移液錯(cuò)誤，請(qǐng)確保移液器吸頭牢固連接，在試劑和樣品之間更換吸頭，消除孔或移液器吸頭中的氣泡，將試劑/樣品分配到孔的側(cè)面，并通過連續(xù)的抽吸/分配循環(huán)沖洗吸頭。
溫馨提示：保留您的試管，直到您分析了結(jié)果。保留用于制備標(biāo)準(zhǔn)品、QC樣品和樣品的試管，可以讓您在稍后發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤時(shí)仔細(xì)檢查稀釋錯(cuò)誤或試管混淆。
常見問題
解決方案
1.無樣品信號(hào)，但標(biāo)準(zhǔn)品和/或 QC 樣品良好
1.如果您的標(biāo)準(zhǔn)/校準(zhǔn)曲線和/或QC樣品顯示信號(hào)，但您的樣品沒有（如預(yù)期），則您的樣品可能有問題。可能出現(xiàn)以下幾種問題：
2.使用新的樣本基質(zhì)：并非所有ELISA都適用于所有樣本類型，使用不同樣本類型可能需要咨詢廠家或重新開發(fā)檢測(cè)方法。
3.稀釋度過高：樣品過度稀釋超過ELISA的靈敏度可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)丟失。
4.分析物低于檢測(cè)限：樣本中可能含有分析物不足，低于ELISA的檢測(cè)限。
5.降解樣本
零信號(hào)
有多種潛在原因可導(dǎo)致零信號(hào)產(chǎn)生：
1.孵育時(shí)間/溫度：驗(yàn)證孵育時(shí)間和溫度是否符合制廠家的說明要求，以避免影響檢測(cè)動(dòng)力學(xué)。
2.捕獲/檢測(cè)抗體不足/不正確：仔細(xì)檢查抗體稀釋度，特別是內(nèi)部制備的試劑，并確保正確訂購(gòu)廠家提供的即用型試劑。
3.添加的捕獲/檢測(cè)試劑不足：確保向板中添加了正確量的試劑。
4.讀取器波長(zhǎng)：確認(rèn)您的平板讀取器上的波長(zhǎng)設(shè)置正確，特別是在使用需要視覺停止的底物時(shí)。
5.底物溶液：使用正確的底物并檢查儲(chǔ)備溶液的有效期。
6.洗板：避免過度劇烈或長(zhǎng)時(shí)間洗板，因?yàn)檫@可能會(huì)洗掉分析物或試劑。
7.干燥孔：防止孔變干，以避免出現(xiàn)不可預(yù)測(cè)的ELISA問題。
常見問題
解決方案
移液誤差
雖然通常歸因于移液誤差，但高 CV 也可能由樣品制備、試劑處理和清洗步驟中的錯(cuò)誤造成。確保稀釋樣品混合正確，以避免重復(fù)樣品之間存在差異。
樣品準(zhǔn)備
將稀釋樣品加入板中之前，大力混合或用移液器吸出稀釋樣品，以避免分析物分布不一致。
試劑準(zhǔn)備
試劑（如捕獲抗體或檢測(cè)抗體）混合不當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致不同孔中的試劑水平不同，從而增加 CV。
洗板
確保徹底、一致地洗板，以防止板上殘留基質(zhì)成分，導(dǎo)致背景信號(hào)增加。
孔內(nèi)氣泡
移液時(shí)盡量減少氣泡，因?yàn)闅馀輹?huì)干擾分析物或試劑。讀取板前應(yīng)消除所有可見氣泡。
邊緣效應(yīng)
注意邊緣效應(yīng)，這可能是由于板上的溫度差異造成的?？刂茰囟炔⒋_保適當(dāng)?shù)脑噭┗旌峡梢跃徑獯藛栴}。
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常見問題 |
解決方案 |
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基于抗體的問題 |
1.包被/檢測(cè)抗體濃度：仔細(xì)檢查捕獲抗體的稀釋度，特別是如果您從頭開始開發(fā)ELISA。在這種情況下，可能需要優(yōu)化包被條件。 2.非特異性結(jié)合：檢查抗體的配方，確保所用的稀釋劑合適，因?yàn)椴患嫒莸南♂寗?huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合。充分的板封閉對(duì)于減少非特異性結(jié)合至關(guān)重要。 3.交叉反應(yīng)性：當(dāng)使用新新批次、新供應(yīng)商或新類型的抗體時(shí)，請(qǐng)使用陰性對(duì)照檢查是否與樣品類型中的其他分析物發(fā)生交叉反應(yīng)。 |
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試劑（緩沖液或底物） |
由于之前的背景較高而重復(fù)檢測(cè)時(shí)，請(qǐng)始終使用新鮮試劑。受污染的緩沖液可能導(dǎo)致背景較高。 |
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基質(zhì)效應(yīng) |
術(shù)語“基質(zhì)效應(yīng)”是指非目標(biāo)樣品基質(zhì)成分產(chǎn)生的信號(hào)干擾。它是指最終測(cè)定讀數(shù)中“所有”樣品成分總和所觀察到的信號(hào)增加。某些基質(zhì)對(duì)最終測(cè)定信號(hào)的影響大于其他基質(zhì)。請(qǐng)咨詢廠家以獲取有關(guān)基于試劑盒的測(cè)定的經(jīng)過驗(yàn)證的樣品類型的信息，或者如果您自己開發(fā)了新的樣品類型，請(qǐng)針對(duì)新樣品類型優(yōu)化您的測(cè)定。 通過加標(biāo)和回收實(shí)驗(yàn)，您可以評(píng)估樣品基質(zhì)對(duì)特定測(cè)定的影響，這在使用組分試劑而非預(yù)格式化試劑盒開發(fā)ELISA時(shí)尤為重要。將已知量的分析物添加到樣品基質(zhì)和用于制備標(biāo)準(zhǔn)的稀釋劑中。然后應(yīng)使用兩種樣品類型完成ELISA并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算響應(yīng)，從而確定測(cè)定中的基質(zhì)效應(yīng)。 如果觀察到明顯的基質(zhì)效應(yīng)，則用與樣品更接近的基質(zhì)（例如細(xì)胞裂解緩沖液或血清）稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。 |
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封閉 |
封閉緩沖液在檢測(cè)中至關(guān)重要，因?yàn)樗梢苑乐狗翘禺愋越Y(jié)合。為了降低高背景，請(qǐng)考慮增加封閉溶液的濃度或添加少量非離子洗滌劑，例如Tween-20。延長(zhǎng)封閉步驟的孵育時(shí)間和使用平板振蕩器也有幫助。 |
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洗板 |
洗板不充分會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)成分殘留在板上，從而導(dǎo)致背景信號(hào)增加。清洗步驟或在清洗步驟之間進(jìn)行短暫孵育可有效降低背景。確保自動(dòng)洗板機(jī)正常運(yùn)行，并且在更換清洗緩沖液之間管路清潔且沖洗干凈。 |
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基底問題 |
如果反應(yīng)未在規(guī)定時(shí)間內(nèi)停止，某些底物（如TMB）可能會(huì)沉淀。請(qǐng)遵循制造商的建議，并在加入終止液后立即讀取板。確保檢測(cè)板底部清潔，以防止干擾板讀取器。 |
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