ELISA實驗技巧：酶標(biāo)板分類與性能判斷

酶標(biāo)板作為ELISA檢測實驗中的輔材，起著舉足輕重的作用并直接影響最終實驗結(jié)果，酶標(biāo)板的好壞主要取決于其對蛋白吸附的靈敏度、板孔間蛋白吸附能力差異以及所采購酶標(biāo)板批次間的差異。因此，選擇一款蛋白吸附靈敏度高、對蛋白吸附能力孔間差異小、批次間差異小的酶標(biāo)板產(chǎn)品，是實驗者獲得可靠、穩(wěn)定實驗結(jié)果的保障。

酶標(biāo)板分類： 根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，酶標(biāo)板有著不同的分類。

一、根據(jù)孔數(shù)，可分為96孔、48孔等，由于酶標(biāo)板主要是配合酶標(biāo)儀用，目前市面上的酶標(biāo)儀最多為96孔，因此酶標(biāo)板最為常用的也是96孔。

二、根據(jù)其底部的不同，又分為平底的，U型底、V型底等。平底的折射率低，適于在酶標(biāo)儀檢測；U型底的酶標(biāo)板折射率較高，方便加樣、吸樣、混勻等操作，可以不用放在酶標(biāo)儀上，直接通過目測觀察顏色變化情況，從而判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)。V底的酶標(biāo)板可以精確的吸取樣品。

三、根據(jù)酶標(biāo)板與蛋白和其它分子結(jié)合能力的不同，又分為高結(jié)合力、中結(jié)合力和氨基化等。

（1) 高結(jié)合力

此種酶標(biāo)板，表面經(jīng)處理后，其蛋白結(jié)合能力大大增強(qiáng)，可達(dá)300~400ng IgG/cm2，主要結(jié)合的蛋白分子量＞10kD。使用該類酶標(biāo)板可提高敏感性，并可相對減少包被蛋白的濃度和用量，不足之處為較易產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。抗原或抗體包被后，以非離子去污劑無法有效地封閉未結(jié)合蛋白的部位，需使用蛋白作為封閉劑。

（2)  中結(jié)合力

此類酶標(biāo)板經(jīng)表面疏水鍵被動與蛋白結(jié)合，適合作為分子量＞20kD的大分子蛋白的固相載體，其蛋白結(jié)合能力為200~300ng IgG/cm2。由于該類酶標(biāo)板所具有的僅與大分子結(jié)合的特性，適用于作為未純化抗體或抗原的固相載體，可降低潛在的非特異性交叉反應(yīng)。該類板可以惰性蛋白或非離子去污劑作為封閉液。

（3) 氨基化

這種酶標(biāo)板經(jīng)表面改性處理后擁有帶正電荷的氨基，其疏水鍵由親水鍵取代。該類酶標(biāo)板適合作為小分子蛋白的固相載體。使用合適的緩沖液和pH值，其表面可通過離子鍵與帶負(fù)電荷的小分子結(jié)合。由于其表面的親水特性和可通過其它交聯(lián)劑共價結(jié)合的能力，可用于固定溶于Triton-100、Tween 20等去污劑的蛋白分子。該類板的缺陷為由于降低了疏水性，一部分蛋白分子無法結(jié)合；此外，其表面需有效地封閉。由于親水和共價的表面特性，使用的封閉液必須能夠與非反應(yīng)性氨基基團(tuán)和所選擇的交聯(lián)劑中任何功能基團(tuán)發(fā)生作用。

四、根據(jù)顏色可分為透明、黑色、白色

透明的是最常用的，用于最一般的酶聯(lián)免疫實驗。相對于透明的的酶標(biāo)板，還有用于發(fā)光檢測用的不透明的酶標(biāo)板，一般有黑色和白色兩種。黑色的酶標(biāo)板自身會有光吸收，所以它的信號相對于白色酶標(biāo)板要低很多，因此一般用于檢測較強(qiáng)的光，如熒光檢測。而白色的酶標(biāo)板就用于較弱的光檢測，常用于一般的化學(xué)發(fā)光。另外黑色的酶標(biāo)板還可以消弱非特異反應(yīng)帶來的問題。同時需要注意的是，用一般的酶標(biāo)板不可以進(jìn)行發(fā)光檢測，因為一般從化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中發(fā)射出的光是各向同性，如果用透明的酶標(biāo)板，光不僅會從垂直方向發(fā)散，還會從水平方向發(fā)散，使得光極易通過各個孔之間的間隙和孔壁，從而導(dǎo)致各孔的光吸收值受到相鄰孔發(fā)射光的影響。

酶標(biāo)板性能判斷

良好的酶標(biāo)板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。酶標(biāo)板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號的酶標(biāo)板在使用前須事先檢查其性能。

常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后，分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計算全部讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%。以下以A、B、C三款酶標(biāo)板為例。

直接法：檢測Human IgG在酶標(biāo)板表面的吸附

雙抗體夾心法：包被山羊抗人抗體檢測陽性血清中抗原

上圖可以看出，這三類酶標(biāo)板中，A類酶標(biāo)板具有更好的蛋白吸附效果，同時也提高蛋白吸附的靈敏度，能夠提供更為可靠的實驗數(shù)據(jù)。

另外，可以詢問酶標(biāo)板的批內(nèi)差異，以下是某款酶標(biāo)板的批內(nèi)差異。

由批內(nèi)差異數(shù)據(jù)圖可以看出，該酶標(biāo)板具有很好地批間穩(wěn)定性，批內(nèi)變異系數(shù)（CV）差異均在5.0％附近，明顯低于業(yè)內(nèi)關(guān)于臨床免疫反應(yīng)用酶標(biāo)板的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中批內(nèi)變異系數(shù)低于10.0%的要求，因此也適合用于ELISA實驗。