【通蔚生物】:ELISA實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)：樣本的收集及保存操作不當(dāng)會(huì)影響ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果

ELISA（酶聯(lián)免疫試驗(yàn)）以其靈敏度較高、特異性好的特點(diǎn)已廣泛用于科研實(shí)驗(yàn)及臨床，越來越多科研單位選擇用ELISA實(shí)驗(yàn)方法完成研究課題。優(yōu)質(zhì)的試劑、好的儀器和正確的操作是保證ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件，但樣本的收集及保存操作不當(dāng)也會(huì)影響ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果。樣本的收集跟保存聽上去貌似很簡(jiǎn)單，但不乏有許多科研工作者因?yàn)闃颖镜氖占４鏇]做好而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

下面針對(duì)樣本收集及保存通蔚生物提幾點(diǎn)建議：
1. 嚴(yán)重溶血，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽性；
2. 混有紅細(xì)胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈；如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)：
3. 標(biāo)本凝固不全，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；
4. 采血試管洗滌不徹底、反復(fù)使用易交叉污染：塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。

血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)，嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。一般說來，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測(cè)定的需－20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存；使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值，可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性；血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?/span>

被檢血清或血漿標(biāo)本，可用含保護(hù)性封阻劑（吐溫-20）或稱濕潤(rùn)劑的緩沖液來稀釋。也可加入一些蛋白質(zhì)，如1%牛血清白蛋白等來稀釋。然后再加到已經(jīng)用抗原或抗體包被的固相載體中進(jìn)行孵育。此種被試標(biāo)本可作一系列稀釋度測(cè)定，也可用一個(gè)稀釋度測(cè)定。對(duì)于作某一個(gè)傳染病的診斷來說，最好先用一系列稀釋度作一批標(biāo)本測(cè)定，求出對(duì)診斷有意義的一個(gè)稀釋度（即測(cè)定劑量反應(yīng)曲線），然后用一個(gè)稀釋測(cè)定即可。最適稀釋度和孵育時(shí)間均需從實(shí)踐中摸索出來，對(duì)一般病原微生物所引起的傳染病的血清學(xué)診斷，以1：200稀釋度測(cè)定比較適當(dāng)，而試驗(yàn)標(biāo)本的(即含抗體)作用時(shí)間一般為室溫或37℃ 1-2小時(shí)。但現(xiàn)在對(duì)有些標(biāo)本（如流腦抗原）測(cè)定時(shí)，僅用37℃ 5分鐘。對(duì)單克隆抗體檢測(cè)也可縮短作用時(shí)間。