ELISA 實驗過程中的常見問題及解決

  上篇文章為大家介紹了《ELISA是什么？它能檢測出什么？》。相信大家對ELISA應(yīng)用有所了解，不過在ELISA實驗中難免會出現(xiàn)問題，今天為大家介紹一下ELISA實驗中常見的問題以及對遇到問題的解決辦法。

  ELISA原理之前文章中有闡述，這里再簡要概述一下，了解ELISA原理有助于應(yīng)對實驗遇到問題。

  Elisa的原理

  通過抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗原也可以是抗體。

  在測定時，受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化水解或氧化還原反應(yīng)而成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。

  所生成有色產(chǎn)物的顏色深淺與欲測的抗原(抗體)含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(酶標(biāo)儀)加以測定。其方法簡單，方便迅速，特異性強。

  Elisa對照

  每次進行ELISA時都應(yīng)進行對照，以確保實驗的準(zhǔn)確性。常見的對照包括陽性和陰性對照、空白孔和質(zhì)量控制樣品。陽性對照含有已知量的目標(biāo)抗原，而陰性對照則不含?？瞻卓撞缓瑯悠坊蛟噭糜跍y量背景信號。質(zhì)量控制樣品用于驗證檢測的準(zhǔn)確度和精密度。

  Elisa問題和解決方案

  空白（B）

  ELISA中使用空白對照孔（B）是為了控制板本身的變異，這些孔不接觸任何樣本或檢測抗體。如果空白孔的OD值升高，可能表明洗板存在問題，需要進一步調(diào)查。常見原因包括洗板機故障、底物過量或其他因素。

  零濃度(ZC)

  ELISA中的零濃度對照(ZC)與空白對照(B)類似，但包括檢測中使用的所有緩沖液和試劑，但不包含目標(biāo)抗原。它可以幫助確定檢測的背景信號，對于計算真正的檢測限(LOD)至關(guān)重要。在實驗運行過程中，ZC的OD值應(yīng)該保持穩(wěn)定，如果出現(xiàn)明顯變化，需要調(diào)查原因，例如洗板機故障、試劑問題或其他因素。定期檢查ZC對照的OD值，并及時排查問題，可以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

  非特異性結(jié)合(NSB)

  NSB對照是ELISA中的另一種對照，它可以評估檢測抗體（標(biāo)記抗體）對總OD信號的非特異性貢獻。在NSB對照中，通常不添加特異性抗原或樣品，而是僅將ELISA板與標(biāo)記抗體和必要的緩沖液（如阻斷緩沖液）孵育。有時，還會采用增強的洗滌步驟來進一步減少非特異性結(jié)合。通過這種方式，NSB對照能夠區(qū)分由特異性抗原-抗體結(jié)合產(chǎn)生的信號與由非特異性因素（如標(biāo)記抗體與ELISA板表面的非特異性吸附）產(chǎn)生的背景信號，從而提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。NSB對照的預(yù)期OD值應(yīng)該略高于空白對照(B)孔，但低于零濃度對照(ZC)孔。如果NSB孔的OD值明顯高于預(yù)期，則可能表明標(biāo)記抗體存在非特異性結(jié)合、封閉不充分或其他因素。正確的試劑制備和輸送對NSB對照和整個實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

  最大結(jié)合(MaxBinding)對照

  最大結(jié)合對照用于估計檢測所能產(chǎn)生的最大信號。它通過將過量的抗原或標(biāo)準(zhǔn)品加入到微孔板中，確保所有捕獲抗體都被結(jié)合，從而確定信號的上限。最大結(jié)合對照對于計算樣本的結(jié)合百分比、識別樣本、底物或檢測抗體的問題至關(guān)重要。

  通蔚建議

  Elisa實驗結(jié)果不一致或不準(zhǔn)確的結(jié)果可能是由于各種因素造成的，例如試劑使用不當(dāng)、孵育不均勻、移液技術(shù)不正確、交叉污染以及ELISA試劑盒質(zhì)量低劣。為了確保ELISA實驗結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性，建議注意以下幾個方面：

  1.試劑管理:

  使用新鮮、適當(dāng)稀釋的試劑，并在移液到板上之前充分混合。

  選擇黑值低、吸附性好的優(yōu)質(zhì)ELISA試劑盒。

  定期校準(zhǔn)儀器，并使用標(biāo)準(zhǔn)品進行質(zhì)量控制。

  2.操作步驟:

  孵育期間使用板密封劑，并避光孵育底物。

  使用移液器時，每次移液前都應(yīng)更換槍頭，并且不要讓移液器接觸孔底，以避免交叉污染。

  確保孵育溫度均勻，避免培養(yǎng)皿堆疊。

  嚴格按照實驗步驟進行操作，并記錄實驗過程。

  3.環(huán)境控制:

  避免陽光直射，避免溫度和濕度劇烈變化。

  保持工作區(qū)域清潔，防止污染。

  4.試劑盒質(zhì)量檢測:

  空白對照(B)和零濃度對照(ZC):評估試劑盒的背景信號和檢測限。

  最大結(jié)合對照(MaxBinding):評估試劑盒的靈敏度和飽和度。

  標(biāo)準(zhǔn)品:使用標(biāo)準(zhǔn)品驗證試劑盒的準(zhǔn)確性和精密度。

  重復(fù)性:進行多次重復(fù)實驗，驗證試劑盒的結(jié)果重復(fù)性。

  最后，ELISA實驗過程遵循良好的實驗室規(guī)范，注意細節(jié)，并使用適當(dāng)?shù)脑噭┨幚砗蛢Υ?，有助于?/span>ELISA實驗中獲得準(zhǔn)確和一致的結(jié)果。