酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)：ELISA樣本處理、收集和保存

  能夠應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的樣本種類比較多，有血清、血漿、細(xì)胞上清液、細(xì)胞裂解液、尿液和組織的勻漿。這些樣本采集和處理方式是截然不同，了解ELISA不同樣本處理、收集和保存是一門必修課。下面上海通蔚針對多年經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出的各類樣本的采集、處理和保存方式。

  一、血清采集、處理和保存

  1.使用促凝管或分離膠促凝管采集2ml血液。

  2.室溫靜置30-60分鐘（或更保守地2小時(shí)），直至血液完全凝固。

  3.4℃，3000rpm離心15-20分鐘。

  4.小心吸取上清液（血清），分裝成小份，避免產(chǎn)生氣泡。

  5.-70℃或更低溫度保存，避免反復(fù)凍融。

  8.實(shí)驗(yàn)使用前，室溫或4℃緩慢解凍，輕輕混勻。

  ELISA實(shí)驗(yàn)中最常用的樣本是血清。采集血液時(shí)，應(yīng)使用促凝管或分離膠促凝管，并嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞釋放的具有過氧化物酶活性的物質(zhì)會干擾基于HRP的ELISA檢測，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。同樣，應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榧?xì)菌也可能含有內(nèi)源性HRP，同樣會導(dǎo)致假陽性。

  二、血漿采集、處理和保存

  1.使用預(yù)先添加了合適抗凝劑（根據(jù)試劑盒說明書選擇）的真空采血管采集血液。

  2.輕輕顛倒采血管幾次，使血液與抗凝劑充分混勻。30分鐘內(nèi)于冰上進(jìn)行后續(xù)操作。

  3.4℃，3000rpm離心10-15分鐘。

  4.小心吸取上清液（血漿），分裝成小份，避免產(chǎn)生氣泡。

  5.-70℃或更低溫度凍存，避免反復(fù)凍融。

  6.實(shí)驗(yàn)使用前，在室溫或4℃緩慢解凍，輕輕混勻。

  三、尿液采集、處理和保存

  1.收集1-10mL晨尿中段，使用干凈無菌的容器。

  2.4℃，3000-4000rpm離心10-15分鐘。

  3.小心吸取上清液，分裝成小份，避免產(chǎn)生氣泡。可以考慮添加合適的蛋白酶抑制劑（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求）。

  4.-70°C或更低溫度凍存，避免反復(fù)凍融。

  5.實(shí)驗(yàn)使用前，在室溫或4°C緩慢解凍，輕輕混勻。如果出現(xiàn)沉淀，可以再次低速離心去除。

  四、胞上清液采集、處理和保存

  1.采集：使用無菌試管采集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

  2.離心：1000-2000g離心5-10分鐘，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。

  3.添加蛋白酶抑制劑(可選但推薦):根據(jù)目標(biāo)蛋白選擇合適的蛋白酶抑制劑。

  4.分裝：將上清液分裝成適合一次實(shí)驗(yàn)用量的小份，避免反復(fù)凍融。

  5.保存：立即置于-80℃或液氮中長期保存。短期內(nèi)（例如幾小時(shí)）需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以暫時(shí)置于冰上。避免-20℃保存。

  ELISA檢測：取出凍存的上清，融化后立即進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。避免反復(fù)凍融。

  五、細(xì)胞裂解液采集、處理和保存

  1.PBS洗滌:使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1-2次。

  2.加入裂解液:選擇合適的裂解液，并添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑。裂解液的體積應(yīng)根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和培養(yǎng)皿大小進(jìn)行調(diào)整。

  3.裂解:冰上裂解一段時(shí)間（例如30分鐘），期間可以進(jìn)行渦旋震蕩或超聲處理，以促進(jìn)細(xì)胞裂解。

  4.離心:4°C下高速離心（例如12,000-15,000xg）10-20分鐘，去除細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞。

  5.收集上清:小心收集上清，避免吸取沉淀。

  6.蛋白濃度測定:使用合適的蛋白濃度測定方法（例如BCA法或Bradford法）測定上清中的蛋白濃度。

  7.分裝:將裂解液分裝成適合一次實(shí)驗(yàn)用量的小份，避免反復(fù)凍融。

  8.保存:立即置于-80°C或液氮中長期保存。短期內(nèi)（例如幾小時(shí)）需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以暫時(shí)置于冰上。避免-20°C保存。

  ELISA檢測:取出凍存的裂解液，融化后立即進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。避免反復(fù)凍融。

  六、各類組織勻漿的采集、處理和保存

  1.組織準(zhǔn)備:采集組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液和多余結(jié)締組織，濾紙拭干，稱重。

  2.選擇勻漿介質(zhì)和添加抑制劑:根據(jù)目標(biāo)蛋白和下游應(yīng)用選擇合適的勻漿介質(zhì)，并加入適量的蛋白酶和磷酸酶抑制劑。

  3.勻漿:根據(jù)組織類型選擇合適的勻漿方法。可以使用手工勻漿、機(jī)器勻漿、高壓勻漿或超聲波破碎等方法。勻漿過程需要在冰上或冰水浴中進(jìn)行。

  4.離心:4°C下高速離心(例如10,000-15,000xg)15-30分鐘，去除細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞。

  5.收集上清:小心收集上清，避免吸取沉淀。

  6.蛋白濃度測定:使用合適的蛋白濃度測定方法測定上清中的蛋白濃度。

  7.分裝:將勻漿液分裝成適合一次實(shí)驗(yàn)用量的小份，避免反復(fù)凍融。

  8.保存:立即置于-80°C或液氮中長期保存。短期內(nèi)（例如幾小時(shí)）需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以暫時(shí)置于冰上。避免-20°C保存。

  ELISA檢測:取出凍存的勻漿液，融化后立即進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。避免反復(fù)凍融。

  ELISA樣本如何處理、收集和保存介紹到這里。ELISA樣本處理、收集和保存是較為關(guān)鍵的一步，它決定下游ELISA實(shí)驗(yàn)成功關(guān)鍵。上述內(nèi)容為大家起到拋磚引玉作用，除此之外可以參考自己的說明書。