ELISA如何判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量

  當(dāng)拿到ELISA試劑盒，我們會(huì)對(duì)目標(biāo)樣本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于初步實(shí)驗(yàn)小伙伴們，ELISA如何判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量？ELISA實(shí)驗(yàn)經(jīng)常用于對(duì)復(fù)雜混合物中的特定蛋白進(jìn)行檢測(cè)和定量分析，結(jié)果出來(lái)后需要一定的方法來(lái)評(píng)估數(shù)據(jù)是否可靠，主要從以下幾個(gè)方面評(píng)估：批內(nèi)精密度、稀釋線性、回收率、靈敏度（檢測(cè)限）等。

  內(nèi)部檢測(cè)準(zhǔn)確度

  ELISA的批內(nèi)準(zhǔn)確度是指在同一批實(shí)驗(yàn)（同一塊酶標(biāo)板、相同試劑、儀器和操作者）中，對(duì)同一樣本進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)量（例如，雙孔或三孔）結(jié)果的一致性。通常使用變異系數(shù)（%CV）來(lái)評(píng)估批內(nèi)準(zhǔn)確度，其計(jì)算方法為：(標(biāo)準(zhǔn)差/平均值)*100%。一般來(lái)說(shuō)，%CV值越小，表示重復(fù)性越好，結(jié)果越可靠。雖然%CV小于10%通常被認(rèn)為是可接受的，但具體可接受的范圍取決于具體的實(shí)驗(yàn)要求和ELISA試劑盒的特性。

  注意：CV大的原因可能有：

  1.移液不準(zhǔn)確。使用前請(qǐng)確保移液器吸頭牢固地安裝在移液器上，以確保吸取正確的液體量；

  2.試劑濺入其他孔中；

  3.樣品或試劑被細(xì)菌或真菌污染；

  4.試劑之間交叉污染；整個(gè)酶標(biāo)板的溫度不一致。這可以通過(guò)將酶標(biāo)板放在遠(yuǎn)離氣流的恒溫環(huán)境中5.孵育來(lái)避免；

  6、有些孔完全干燥。這就要求在孵育過(guò)程中微量滴定板需要始終蓋上蓋子。

  稀釋線性

  稀釋線性是指樣品在經(jīng)過(guò)一系列稀釋后，測(cè)得的濃度值與稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系。理想情況下，將樣品稀釋后，測(cè)得的濃度值應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比。例如，將樣品稀釋2倍，測(cè)得濃度值應(yīng)為原濃度值的一半；稀釋4倍，測(cè)得濃度值應(yīng)為原濃度值的四分之一，以此類(lèi)推。通過(guò)繪制稀釋倍數(shù)和測(cè)得濃度值的曲線圖，可以評(píng)估樣品的稀釋線性。良好的稀釋線性表現(xiàn)為一條直線，表明在該稀釋范圍內(nèi)，測(cè)定方法的準(zhǔn)確性和可靠性較高。

  基質(zhì)效應(yīng)會(huì)影響稀釋線性。當(dāng)存在基質(zhì)干擾時(shí)，樣品稀釋可以降低基質(zhì)的濃度，從而減弱其對(duì)測(cè)量結(jié)果的干擾。因此，評(píng)估稀釋線性也有助于判斷基質(zhì)效應(yīng)的存在和程度。如果樣品在不同稀釋倍數(shù)下的測(cè)量結(jié)果偏離線性關(guān)系，則可能存在基質(zhì)效應(yīng)。

  回收率

  回收率用于評(píng)估樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)檢測(cè)的影響以及方法的準(zhǔn)確性。它是通過(guò)在樣品中加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（加標(biāo)），然后測(cè)定加標(biāo)后樣品中目標(biāo)物質(zhì)的濃度來(lái)確定的?；厥章?/span>(%)=[(加標(biāo)樣品測(cè)定值-未加標(biāo)樣品測(cè)定值)/加標(biāo)量]*100%。理想的回收率是100%。雖然80%-120%通常被認(rèn)為是可接受的范圍，但具體可接受的范圍需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)和分析物的特性來(lái)確定。如果回收率過(guò)高或過(guò)低，說(shuō)明樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)存在干擾，例如基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。例如，在空白血清中加入已知濃度的IL-2，如果回收率低于預(yù)期，則提示血清中存在干擾因素，影響了抗體與IL-2的結(jié)合。

  靈敏度（檢測(cè)限）

  靈敏度是指分析方法能夠區(qū)分開(kāi)的最低分析物水平，通常用檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)來(lái)表示。

  1.空白限值(LOB):指的是在重復(fù)測(cè)量空白樣品時(shí)，以一定概率（通常為95%）觀察到的最大測(cè)量值。LOB反映了背景噪音的水平。

  2、檢測(cè)限(LOD):指的是能夠以一定置信度（通常為95%）與空白樣品區(qū)分開(kāi)的最低可檢測(cè)分析物濃度。

  3.定量限(LOQ):指的是能夠在滿足預(yù)定的準(zhǔn)確度和精密度要求的前提下，可靠定量的最低分析物濃度。LOQ通常高于LOD。

  LOD和LOQ的確定通?；趯?duì)低濃度樣品和空白樣品的重復(fù)測(cè)量，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行計(jì)算。它們之間的關(guān)系可以用信號(hào)與噪音的比喻來(lái)理解：LOD是信號(hào)勉強(qiáng)能從噪音中區(qū)分出來(lái)的水平，而LOQ是信號(hào)足夠強(qiáng)，可以進(jìn)行可靠定量的水平。

  信噪比

信噪比(Signal-to-NoiseRatio,S/N)是衡量信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)于背景噪聲強(qiáng)度的指標(biāo)。在分析化學(xué)中，信噪比越高，表明分析方法的靈敏度越高，更容易區(qū)分信號(hào)和噪聲。

上述是ELISA判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的幾個(gè)指標(biāo)。掌握這些實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，在未來(lái)進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞。