免疫印跡法的原理和步驟

  Westernblot，又稱免疫印跡法，是由Towbin等人在1979年發(fā)展完善，并由W.NealBurnette于1981年命名的常用蛋白質(zhì)分析方法。該技術(shù)可用于定性和半定量分析蛋白質(zhì)。Westernblot主要包括三個(gè)步驟：按大小分離蛋白質(zhì)（通常使用SDS-PAGE），將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體支持物（例如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，以及使用抗體（通常是一抗和二抗）標(biāo)記目標(biāo)蛋白質(zhì)以便進(jìn)行可視化。需要注意的是，Westernblot的半定量分析需要謹(jǐn)慎操作并使用合適的內(nèi)參對(duì)照。

  WesternBlot的原理

  Westernblot是一種利用抗體特異性檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)。首先，蛋白質(zhì)樣品通過(guò)SDS-PAGE按分子量大小分離，然后通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移到固相支持物（例如NC膜或PVDF膜）上。膜通過(guò)疏水作用和靜電作用吸附蛋白質(zhì)。為了防止抗體非特異性結(jié)合，使用封閉液（例如蛋白質(zhì)溶液、脫脂牛奶或BSA）封閉膜上未結(jié)合蛋白質(zhì)的位點(diǎn)。接下來(lái)，將膜與針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的一抗孵育，使一抗特異性結(jié)合到目標(biāo)蛋白質(zhì)上。洗滌去除未結(jié)合的一抗后，再用標(biāo)記的二抗孵育。二抗與一抗結(jié)合，并通過(guò)其標(biāo)記物（例如酶或熒光染料）放大信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的可視化和檢測(cè)。通過(guò)比較條帶的強(qiáng)度，可以對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量分析。

  WesternBlot步驟

  蛋白質(zhì)印跡法涉及六個(gè)步驟，包括樣品制備、凝膠電泳、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移、阻斷、抗體孵育以及蛋白質(zhì)檢測(cè)和可視化。

  1.樣品制備

  蛋白質(zhì)可以從不同的樣品中提取，例如組織或細(xì)胞。由于組織樣品的結(jié)構(gòu)程度較高，因此首先通過(guò)機(jī)械裝置（例如均質(zhì)機(jī)或超聲處理）分解組織。通常使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑來(lái)防止樣品在低溫下消化。蛋白質(zhì)提取后，檢測(cè)蛋白質(zhì)的濃度很重要，這允許測(cè)定每個(gè)孔中裝入的蛋白質(zhì)的質(zhì)量。分光光度計(jì)通常用于蛋白質(zhì)濃縮。

  2.凝膠電泳

  最常用的凝膠是聚丙烯酰胺凝膠(PAG)和裝有十二烷基硫酸鈉(SDS)的緩沖液。Westernblot使用兩種類型的瓊脂糖凝膠：濃縮凝膠用于將所有蛋白質(zhì)濃縮在一個(gè)帶中，分離凝膠可根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行分離。在SDS-PAGE中，施加電壓時(shí)，較小的蛋白質(zhì)遷移得更快。PAGE可以根據(jù)由不同濃度的PAG控制的均勻孔徑分離從5到2,000kDa的蛋白質(zhì)。通常分離凝膠的濃度為5%、8%、10%、12%或15%。當(dāng)我們選擇適當(dāng)百分比的分離凝膠時(shí)，我們應(yīng)該考慮目標(biāo)蛋白質(zhì)的大小。已知的蛋白質(zhì)重量越小，就應(yīng)該使用更高百分比的凝膠。

  3.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移

  通過(guò)凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后，蛋白質(zhì)從凝膠內(nèi)部轉(zhuǎn)移到固體支持膜上，使蛋白質(zhì)可被抗體檢測(cè)到。轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的主要方法稱為電印跡，它使用垂直于凝膠表面的電場(chǎng)將蛋白質(zhì)從凝膠中拉出并移入膜中。它可以在半干或濕條件下進(jìn)行，而濕條件通常更可靠，因?yàn)樗惶赡苁鼓z變干。如左圖所示，膜位于凝膠表面和過(guò)濾器之間。轉(zhuǎn)移夾層如下形成：纖維墊（海綿）、濾紙、凝膠、膜、濾紙、纖維墊（海綿）。

  4.封閉

  封閉是Westernblot中的一個(gè)重要步驟，可以防止抗體非特異性地結(jié)合到膜上。最常用的典型封閉劑是BSA和脫脂奶粉。當(dāng)膜放入蛋白質(zhì)的稀溶液中時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)附著在膜上所有目標(biāo)蛋白質(zhì)尚未附著的地方。這樣可以減少Westernblot最終產(chǎn)物中的“噪音”，從而得到更清晰的結(jié)果。

  5.抗體孵育

  阻斷后，將一抗與膜孵育，一抗即可與目標(biāo)蛋白結(jié)合。一抗的選擇取決于要檢測(cè)的抗原。用抗體緩沖液沖洗膜有助于減少背景并去除未結(jié)合的抗體。沖洗膜后，將膜暴露于特異性酶標(biāo)記的二抗中。進(jìn)行二抗孵育時(shí)，標(biāo)記的二抗可以與已與目標(biāo)蛋白反應(yīng)的一抗結(jié)合。根據(jù)一抗的種類，我們可以選擇合適的二抗。

  6.蛋白質(zhì)檢測(cè)和可視化

  底物與結(jié)合到二抗上的酶發(fā)生反應(yīng)，生成有色物質(zhì)。它使我們能夠知道目標(biāo)蛋白質(zhì)的密度和位置。通過(guò)將蛋白質(zhì)條帶與標(biāo)記進(jìn)行比較，可以得到大小近似值。有幾種檢測(cè)系統(tǒng)可用于蛋白質(zhì)可視化，例如比色檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)、放射性檢測(cè)和熒光檢測(cè)。電化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)是最常見(jiàn)的檢測(cè)方法。

  Westernblot通常用于定性檢測(cè)蛋白質(zhì)和翻譯后修飾（例如磷酸化）。除此之外，它還可用于醫(yī)學(xué)診斷，例如HIV檢測(cè)或BSE檢測(cè)。