酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的基本原理

  談起elisa，想必大家并不陌生，elisa又叫“酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)”。1971年elisa問世，是由瑞典科學(xué)家波爾諾斯（Per-?ke Persson）和克勞斯·克倫契（Claus K?hler）首次描述"固相酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)"。他們將酶與抗體或抗原結(jié)合到固定的固體表面上，實(shí)現(xiàn)了抗體和抗原的高度敏感和特異性檢測(cè)。下面由通蔚詳細(xì)給大家介紹一下elisa試劑盒原理。

elisa實(shí)驗(yàn)原理示意圖

  一、原理：免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理，對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個(gè)部分組成：免疫識(shí)別，信號(hào)輸出和數(shù)據(jù)處理。

  二、步驟：免疫識(shí)別是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗體，而后利用抗體識(shí)別待測(cè)的抗原（通常是疾病的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，病毒，細(xì)菌等等，從復(fù)雜待測(cè)液中將抗原吸附到96孔板表面。接著用帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、熒光或放射性標(biāo)記的抗體通過直接或者間接的方式輸出識(shí)別信號(hào)。最后利用信號(hào)強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度等信息計(jì)算得出待測(cè)樣中目標(biāo)抗原的濃度。

  根據(jù)免疫識(shí)別和信號(hào)輸出方式的不同，ELISA可以分為雙抗體夾心法、直接免疫競(jìng)爭(zhēng)法和非直接免疫競(jìng)爭(zhēng)法等等。其中雙抗體夾心法在商業(yè)應(yīng)用上最常見。

  雙抗體夾心法：

       ①：抗體包被 在96孔板上包被抗體。由于酶標(biāo)板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯環(huán)與抗體的氨基酸殘基具有類似π-π堆積作用的引力，結(jié)合靜電和疏水作用，可以將抗體吸附于其表面。然后，將未吸附的抗體用緩沖液清洗后，加入含有明膠或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封閉液以封閉酶標(biāo)板上未結(jié)合抗體的部分。加入封閉液的目的，是防止其他蛋白因靜電或疏水作用吸附在96孔板上，造成假陽(yáng)性信號(hào)，干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

  ②：免疫識(shí)別 在96孔板上包被抗體后，加入待測(cè)樣，并在37°C環(huán)境下孵育一段時(shí)間，通常是1-2小時(shí)。此時(shí)酶標(biāo)板上的抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行特異性識(shí)別結(jié)合。此處抗體的質(zhì)量是關(guān)鍵，好的抗體既能特異性高效地結(jié)合抗原又不受待測(cè)樣中其他生物大分子、蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽等成分的影響。

  ③：洗板 將未結(jié)合的抗原洗掉，加入該抗原所對(duì)應(yīng)的識(shí)別抗體并在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時(shí)，接著將未連接上抗原的抗體洗掉。

  ④：酶標(biāo)信號(hào)輸出 加入帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，用于和標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)合。在培養(yǎng)30分鐘后洗掉未連接的二抗，并加入顯色劑顯色。根據(jù)顯色的結(jié)果判斷抗原的濃度。一般認(rèn)為，抗原濃度與顯色后的發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)。

雙抗體夾心法原理示意圖 

 免疫競(jìng)爭(zhēng)法

  以抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體為例，在上述免疫夾心法操作步驟的第二步加入待測(cè)抗原后，立刻加入酶標(biāo)抗原，使之與待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)識(shí)別酶標(biāo)板上的抗體。當(dāng)待測(cè)抗原濃度越高，能夠連上酶標(biāo)板上抗體的酶標(biāo)抗體就越少，輸出的信號(hào)就越少。這樣待測(cè)樣濃度與酶顯色信號(hào)就呈逆相關(guān)。

競(jìng)爭(zhēng)ELISA原理示意圖

  上述為大家介紹“酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)”的基本原理，希望通過這些原理可以讓您更加明白和認(rèn)識(shí)elisa實(shí)驗(yàn)步驟。上海通蔚生物一直致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供一流的科研試劑和完善的技術(shù)服務(wù)，滿足生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生物科技實(shí)驗(yàn)需求。