酶聯(lián)免疫吸附測定：生物醫(yī)學研究中的得力助手

  什么是酶聯(lián)免疫吸附測定？我們普通口語常說的elisa其實叫“酶聯(lián)免疫吸附測定”，ELISA是使用抗體的免疫測定（免疫測定）之一。抗體是由于異物抗原進入體內引起免疫反應而產生的蛋白質。抗體屬于免疫球蛋白(Ig)蛋白質家族。免疫球蛋白(Ig)有以下類別：

  G(IgG)、M(IgM)、A(IgA)、D(IgD)和E(IgE)。免疫測定中使用的抗體主要是IgG。IgG是一種分子量約為146,000的糖蛋白，由兩條H鏈（分子量約為50,000）和兩條L鏈（分子量約為25,000）組成?？贵w具有僅與導致其產生的抗原結合的特性（特異性結合能力）?？乖且环N物質，具有：

  1)產生抗體的特性（免疫原性）和與抗體特異性結合的特性（特異性結合）。

  2)與抗體結合但不具有產生抗體特性的物質稱為半抗原。一般來說，大分子量的物質，例如蛋白質，具有充當抗原的特性。

  3)分子量小于1000的物質，例如類固醇激素或寡肽，它們像蛋白質一樣由氨基酸連接而成，但氨基酸數(shù)量較少，因此分子量較小，無法產生抗體，具有半抗原特性。問題是，為什么有抗體與半抗原結合，即使它們不產生抗體。事實上，當半抗原與大蛋白質分子（稱為載體）結合并進行免疫時，就可以產生抗體。免疫學測定是使用抗體作為結合試劑的測定，抗體具有僅與目標物質結合的優(yōu)異的特異性結合能力，以及允許它們結合微量物質的強親和力。

  ELISA是一種使用抗體和酶的測量方法

  ELISA中如何使用抗體？ELISA通常使用96孔的微孔板。首先，抗體被吸附到孔的表面（也稱為涂層或固定）。這種抗體稱為捕獲抗體，用于捕獲作為待測物質的抗原?？贵w可以被認為大致呈Y形。Y尖端有一個可變區(qū)，可識別并結合抗原。抗體吸附在孔底手柄易吸附的部分。孔的材料主要是聚苯乙烯，天然很容易吸附蛋白質，但考慮到各種結構后，它變成了特別容易吸附蛋白質的材料。當向其中添加抗體溶液時，會自動發(fā)生吸附。通過吸附盡可能多的抗體，甚至可以捕獲極少量的抗原。

  那么，如何使用捕獲抗體呢？我們用示意圖來解釋一下。為了屏幕方便，這里僅顯示一種抗體。事實上，許多抗體被吸附。

圖1、elisa試劑盒

  將含有抗原的溶液（標準溶液、標本或測量樣品）加入到孔中固定化抗體中，并放置一段時間，通常為1至2小時，直至抗原與抗體結合?？贵w.馬蘇.結合完成后，丟棄多余的溶液并清洗孔。這樣，只有與固定化抗體結合的抗原保留在孔中。

  接下來，添加一種抗體（稱為第二抗體），該抗體可識別與抗原捕獲抗體所識別的表位不同的表位。我會把它留一會兒。該第二抗體預先與酶化學結合。添加的酶標記第二抗體識別并結合與捕獲抗體結合的抗原。然后，洗去多余的酶標二抗。接下來，添加酶的顯色底物溶液以允許酶反應發(fā)生。顯色底物通過酶的作用轉化為色素。因此，通過添加反應終止液來終止酶反應后，使用96孔微孔板比色計測量染料的顯色。這樣，可以將與捕獲抗體結合的抗原的量作為染料進行測量。比色測定的結果以吸光度表示，因此以標準品的測定結果為橫軸，以抗原濃度，縱軸為吸光度，繪制校準曲線，計算出樣品中抗原的量由此。圖中所示的ELISA實現(xiàn)方法是最簡單的方法。由于酶的分子量相當大，使用該方法時，用酶標記抗體可能會對抗體的結合能力造成空間阻礙。

圖2、elisa夾心法

  設計了一種通過將酶與另一種蛋白質結合來減少抗體的空間位阻的方法。如圖所示，二抗帶有生物素標記。生物素是一種分子量非常小的物質。生物素是一種原本存在于生物體中的生理活性物質，蛋清中含有一種叫做親和素的蛋白質，它與生物素的結合力非常強。通過將酶與該親和素結合，并使其與與抗原結合的生物素標記的第二抗體反應，可以克服空間位阻。這種改進方法也用于ELISA。ELISA也稱為夾心法，因為它采用抗體-抗原-抗體格式。