哪種 ELISA 技術(shù)適合您科研？一文為您解析

  酶聯(lián)免疫吸附測定 ( ELISA ) 由 Engvall 和 Perlmann (1971)首次提出，最初用于檢測免疫球蛋白 G。這種免疫測定是對當時常見的放射免疫測定的一個可喜的變化，后者利用放射性標記的抗體和抗原。ELISA 的發(fā)展基于 20 世紀 60 年代的觀察，即抗體或抗原可以吸附到固體表面并仍然參與高親和力結(jié)合。術(shù)語 ELISA 現(xiàn)在指的是多種免疫測定法，其中一些不涉及酶促反應。然而，所有 ELISA 的共同點是使用抗體，抗體在確定測定的靈敏度和特異性方面發(fā)揮著重要作用。

  ELISA 用于生物醫(yī)學研究和發(fā)現(xiàn)的多個領域以及診斷目的。進行 ELISA 的方法有很多種，確定哪一種方法最適合解決您的特定研究問題取決于多種因素，包括所需的靈敏度或檢測的具體內(nèi)容。在這里，上海通蔚生物描述了不同類型的 ELISA，重點介紹每種類型的優(yōu)點和缺點，以及選擇 ELISA 技術(shù)之前應考慮的事項。

  有哪些類型的 ELISA？

  有四種 ELISA 技術(shù)可應用于您的研究。選擇合適的抗體取決于可用的抗體、所需的結(jié)果以及樣品的復雜性。ELISA 技術(shù)包括：直接 ELISA、間接 ELISA、夾心 ELISA 和競爭或抑制 ELISA。

  直接ELISA

圖 1 展示了直接 ELISA 的典型設置。通常，抗原被固定至多孔板。然后通過直接與辣根過氧化物酶 (HRP) 等酶綴合的抗體檢測抗原。

圖1 直接elisa

  優(yōu)點：

  1. 由于所需步驟較少，因此比其他 ELISA 技術(shù)快得多。

  2. 由于所需試劑和步驟較少，因此測定不易出錯。

  缺點：

  1. 由于固定抗原的方法不具有特異性，這可能會導致比間接 ELISA 更高的背景噪音（如下所述）。這主要是因為樣品中的所有蛋白質(zhì)（包括目標蛋白質(zhì)）都會與板結(jié)合。

  2. 靈活性較差，因為每種靶蛋白都需要特定的綴合一抗。

  3. 無信號放大，降低了測定靈敏度。

  直接ELISA應用范圍：

  當需要分析針對抗原的免疫反應時，通常使用直接 ELISA 技術(shù)。

  間接ELISA

在該 ELISA 技術(shù)中，分兩步檢測固定在多孔板上的抗原。首先，未標記的一抗（通常是單克?。┙Y(jié)合特定抗原。其次，應用針對一抗宿主物種的酶聯(lián)二抗（通常是多克?。?。

圖2 間接elisa

  優(yōu)點：

  1. 靈敏度高，因為多個標記的二抗可以結(jié)合一抗。

  2.經(jīng)濟，因為需要更少的標記抗體。

  3. 具有靈活性，因為不同的一抗可以與單一標記的二抗一起使用。

  缺點：

  1. 由于使用二抗而可能發(fā)生交叉反應，這可能會增加背景噪音。

  2. 由于需要與二抗孵育步驟，因此比直接 ELISA 技術(shù)的程序更長。

  間接ELISA應用范圍:

  間接 ELISA 技術(shù)適用于測定樣品中的總抗體濃度。

  夾心ELISA

  夾心 ELISA 需要使用匹配的抗體對（捕獲抗體和檢測抗體）。因此，每種抗體對抗原的不同且不重疊的區(qū)域或表位具有特異性。重要的是，在 ELISA 中專門測試匹配的抗體對，以確保它們檢測到不同的表位，從而獲得準確的結(jié)果。夾心 ELISA 的程序包括用捕獲抗體涂覆聚苯乙烯板。然后添加分析物或樣品，然后添加檢測抗體。檢測抗體可以是酶聯(lián)的，在這種情況下，這被稱為直接夾心 ELISA。如果使用的檢測抗體未標記，則需要酶聯(lián)檢測二抗。這稱為間接夾心 ELISA。

單克隆和多克隆抗體均可用于夾心 ELISA。然而，多克隆抗體通常用作捕獲抗體，以盡可能捕獲最大量的抗原。

圖3 夾心elisa

  優(yōu)點：

  1、靈敏度高；其靈敏度比直接或間接 ELISA 高 2-5 倍。

  2.使用兩種抗體，特異性高。

  3. 提供靈活性，因為可以使用直接和間接方法。

  缺點：

  如果不使用標準化 ELISA 試劑盒或經(jīng)過測試的抗體對，抗體優(yōu)化可能會很困難，因為減少捕獲抗體和檢測抗體之間的交叉反應非常重要。

  夾心ELISA應用范圍：

  夾心 ELISA特別適合分析復雜樣品，因為在使用這種方法進行測量之前不需要純化抗原。

  競爭/抑制 ELISA

競爭/抑制 ELISA，也稱為封閉 ELISA，可能是所有 ELISA 技術(shù)中最復雜的。然而，上述每種測定類型都可以適應競爭形式。競爭/抑制 ELISA 主要用于通過檢測預期信號輸出中的干擾來測量樣品中抗原或抗體的濃度。本質(zhì)上，樣品抗原或抗體與參考分別競爭結(jié)合有限量的標記抗體或抗原。樣品抗原濃度越高，輸出信號越弱，表明信號輸出與樣品中抗原的量成反比。

圖4 競爭ELISA

  圖 4 顯示了基于直接檢測方法的競爭 ELISA 測試抗原的示例。在此示例中，使用已知抗原包被多孔板。按照標準封閉和洗滌步驟，添加含有未知抗原的樣品。然后使用標記的檢測抗體使用相關(guān)底物（例如3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺或TMB）進行檢測。如果樣品中抗原濃度高，則會觀察到信號輸出顯著減少。相反，如果樣品中的抗原非常少，則預期信號輸出將幾乎沒有減少。在圖 4 所示的示例中，信號輸出將會減少。

  優(yōu)點：

  1. 競爭性ELISA的主要優(yōu)點是無需樣品處理，可以使用粗制或不純的樣品。

  2. 與夾心 ELISA 相比，對樣品稀釋和樣品基質(zhì)效應的敏感性較低。

  3. 重復樣品之間和測定之間的變異性較小。

  4. 實驗設置具有最大的靈活性，因為它可以基于直接、間接或夾心 ELISA。

  缺點：

  由于每種 ELISA 技術(shù)都可以適應競爭性形式，因此上述每種 ELISA 技術(shù)所描述的相同限制將適用于相應的競爭性/抑制 ELISA 技術(shù)。

  當只有一種抗體可用于感興趣的抗原時，通常使用競爭/抑制 ELISA 技術(shù)。它還適用于檢測不能被兩種不同抗體結(jié)合的小抗原，例如夾心 ELISA 技術(shù)。

  選擇合適的 ELISA 技術(shù)時要考慮的事項

  如上所述，有許多因素決定哪種 ELISA 技術(shù)適合解決您的研究問題。在決定哪一個適合您之前需要考慮以下幾個問題:

  您需要檢測什么？

  例如，如果檢測具有多個表位的大蛋白（例如細胞因子），則夾心 ELISA 將是最合適的。然而，如果檢測到半抗原等小分子，那么在這種情況下競爭性 ELISA 會更合適。

  有哪些試劑可用于您感興趣的抗原或抗體

  如果只有一種抗體可用于感興趣的抗原，則可以應用直接或競爭性 ELISA。

  您想測量免疫反應或分析物嗎？

  如果您需要檢測或定量分析物，則可以使用夾心法或競爭性 ELISA。然而，如果您需要測量免疫反應，那么直接或間接 ELISA 最適合您的需求。