原代細胞純化難題？這些方法幫你搞定！

  原代細胞是從生物組織或器官直接分離和培養(yǎng)的細胞，是細胞研究中不可獲取的一環(huán)。原代細胞通?；祀s著多種細胞類型，需要根據(jù)實驗目的分離出特定類型的細胞。原代細胞分離和純化在初期細胞培養(yǎng)時比較關鍵。下面上海通蔚生物介紹原代細胞純化方法，原代細胞純化方法如下：

  自然純化法：

  原代細胞在傳代培養(yǎng)過程中會受到培養(yǎng)條件的影響，例如生長因子、培養(yǎng)基成分等，一些細胞類型可能在特定條件下具有更強的增殖能力，從而在培養(yǎng)體系中富集，形成所謂的‘自然純化’。這種方法的缺陷在于無法自由選擇要培養(yǎng)的細胞，并且無法保證獲得高純度的特定細胞類型。因此，需要結合人工純化方法，例如免疫磁珠分離、流式細胞術等，才能有效地分離出目標細胞，并確保其純度和特性。

  人工純化法：

  人工純化方法在細胞純化方面應用廣泛，它通過各種技術手段，例如酶消化純化法和機械刮分法等，利用細胞本身的特性，或者根據(jù)細胞的特定性質，實現(xiàn)對目標細胞的富集和分離。

  一、酶消化純化法

  利用特定的酶，例如胰蛋白酶、膠原酶等，來降解細胞之間的連接，從而將組織分離成單個細胞。這個過程需要人工控制酶的濃度、消化時間等，才能獲得最佳效果。這種純化方法不僅適用于貼壁細胞，同樣適用于半貼壁細胞和黏附細胞等。

  酶消化純化法步驟：

  1.準備工作：

  將細胞培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中預熱至室溫。

  將0.25%胰蛋白酶溶液置于37℃水浴中預熱至室溫。

  準備適量的完全培養(yǎng)基，并置于37℃水浴中預熱至室溫。

  2.酶消化：

  將原有培養(yǎng)基從細胞培養(yǎng)瓶中吸出，用PBS緩沖液清洗細胞一次。

  加入1-2mL預熱的0.25%胰蛋白酶溶液，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶覆蓋細胞表面。

  將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化，消化時間根據(jù)細胞類型和培養(yǎng)密度而定，通常為5-15分鐘。

  在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，當大部分細胞從培養(yǎng)皿中脫落，呈圓形狀態(tài)時，即可停止消化。

  3.終止消化：

  加入等量的預熱的完全培養(yǎng)基，終止胰蛋白酶消化。

  輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使細胞懸液均勻分布。

  將細胞懸液轉移至離心管中。

  4.離心：

  將離心管置于離心機中，以1000rpm離心5分鐘，收集細胞沉淀。

  5.重懸細胞：

  吸出上清液，加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細胞沉淀，使細胞重懸。

  6.計數(shù)細胞：

  使用血球計數(shù)板計數(shù)細胞數(shù)量，確定細胞濃度。

  7.接種細胞：

  將適量的細胞懸液接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，繼續(xù)進行培養(yǎng)。

  8.傳代培養(yǎng)：

  當細胞生長至80-90%匯合度時，需要進行傳代培養(yǎng)，重復上述步驟。

  二、機械刮分法

  機械刮分法則是利用工具，例如刮刀或刷子，將細胞從培養(yǎng)皿或組織上刮下來，從而實現(xiàn)分離。這個過程也需要人工操作，需要控制刮分的力度和范圍，避免損傷細胞。

  機械刮分法步驟：

  1.準備工作：

  將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，確定目標細胞類型和生長區(qū)域。

  準備合適的培養(yǎng)基，并置于37℃水浴中預熱至室溫。

  選擇合適的刮刀或刷子，并進行消毒處理。

  2.機械刮分：

  用無菌的刮刀或刷子，輕輕刮取非目標細胞所在的區(qū)域，使其懸浮于培養(yǎng)基中。

  操作時要注意力度，避免損傷目標細胞。

  可以分多次進行刮分，每次刮取一小部分非目標細胞，直到將非目標細胞盡可能地分離出來。

  3.沖洗：

  使用無菌的吸管吸取培養(yǎng)基，將刮分下來的非目標細胞懸液轉移到離心管中。

  用新鮮的培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)瓶，確保將剩余的非目標細胞沖洗干凈。

  4.離心：

  將離心管置于離心機中，以1000rpm離心5分鐘，收集細胞沉淀。

  5.重懸細胞：

  吸出上清液，加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細胞沉淀，使細胞重懸。

  6.接種細胞：

  將細胞懸液接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，繼續(xù)進行培養(yǎng)。

  7.重復操作：

  如果需要進一步提高細胞純度，可以重復上述步驟，直到獲得滿足實驗要求的純度。

  三、反復貼壁培養(yǎng)法

  反復貼壁培養(yǎng)法是一種利用細胞的貼壁特性進行細胞純化的方法，也稱為差速貼壁法。

  反復貼壁培養(yǎng)法步驟：

  初始培養(yǎng)：將混合細胞接種到培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)一段時間，使貼壁能力強的細胞附著在培養(yǎng)皿底部。

  去除懸浮細胞：將培養(yǎng)基和懸浮細胞吸出，留下貼壁的細胞。

  重新培養(yǎng)：加入新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞。

  重復步驟：重復步驟2和3，將懸浮細胞去除，并將貼壁細胞進行再次培養(yǎng)。

  純化：經(jīng)過多次重復步驟后，貼壁能力強的細胞會逐漸富集，最終獲得相對純化的細胞。

  上述是原代細胞的分離和純化方法介紹，具體選擇哪種純化方法要結合細胞類型和實驗需求進行選擇。上海通蔚生物祝福您在原代細胞純化中更上一層樓。