了解His標簽：實驗室中的重要工具

  在實驗室里或許你或多或少接觸過His檢測，His也叫“組氨酸標簽（Histidinetag）”，它具有蛋白質純化和檢測作用。通過使用His標簽，科研人員能夠快速、有效地獲得高純度的目標蛋白質，并在各種實驗中對其進行詳細分析。廣泛應用于基礎研究、結構生物學、功能研究以及生物技術和醫(yī)藥開發(fā)等領域。接下來，上海通蔚詳細給大家介紹一下His標簽。相關閱讀：什么是HIS試劑盒？一文了解其用途研究

  His標簽的基本原理和功能

  His標簽的組成

  His標簽是由6個組氨酸殘基首尾相連組成的短肽序列，通常連接在蛋白質的N端或C端，用于重組蛋白的分離和純化。由于His標簽分子量小，它對重組蛋白的結構及生物活性通常沒有顯著影響。His標簽能夠與鎳離子（Ni2?）或鈷離子（Co2?）結合，通過金屬親和層析進行純化。His標簽的存在也允許通過抗His標簽抗體進行特異性識別，從而用于定性和定量檢測His融合蛋白的表達、細胞內定位等。

  His標簽的基本原理

  His標簽蛋白純化通常采用固定化金屬離子親和層析（IMAC）純化的方法。這種方法利用了His標簽與金屬離子的特殊相互作用，實現(xiàn)了對目標蛋白的分離和純化。

  原理概述：His標簽是由多個組氨酸殘基組成的短肽，具有與鎳（Ni2?）、鈷（Co2?）等金屬離子結合的能力。在IMAC層析柱中，這些金屬離子通過螯合配體固定在介質上，形成了親和層析填料。

  吸附和洗脫：帶有His標簽的蛋白在經(jīng)過裝配了金屬離子的層析介質時能夠選擇性結合在介質上，而其他雜質蛋白則不能或僅能微弱結合。通過調節(jié)洗脫緩沖液中的咪唑濃度，可以競爭性地洗脫目標蛋白，從而實現(xiàn)分離和純化。

  選擇的金屬離子：在His標簽蛋白純化中，常用的金屬離子包括Ni2?、Co2?和Cu2?。其中，Ni2?是最常用的金屬離子，通常選擇Ni-NTA親和層析柱進行純化。

  His標簽的主要功能

  蛋白質的親和純化

  在大腸桿菌等原核系統(tǒng)中表達的多組氨酸標簽（His標簽）重組蛋白通常通過固定化金屬離子親和層析（IMAC）進行純化。在此過程中，載體材料（通常是珠狀瓊脂糖或磁性顆粒）衍生化為具有適當配體（如腈三乙酸（NTA）或亞氨基二乙酸（IDA））的形式。

  這些配體將固定所需的二價金屬離子（如鎳、銅、鈷和/或鋅），而這些金屬離子又負責與目標生物分子和蛋白質混合物結合和分離。在選擇配體時，需要考慮要純化的蛋白質性質以及使用的金屬離子。以下是對金屬離子的選擇的更詳細描述：

  鎳（Ni2?）：是最常用的金屬離子之一，對His標記蛋白具有較高的親和力和選擇性。然而，它可能會與含有組氨酸簇的內源性蛋白質非特異性結合。

  鈷（Co2?）：與組氨酸標簽具有更特異的結合，因此在追求純度的情況下是首選的二價陽離子。

  銅（Cu2?）：與His標簽的結合力更強，但其特異性較低。因此，在不要求高純度的情況下才使用銅IMAC。

  對于每種金屬離子，都需要權衡其親和性和特異性，并根據(jù)實驗的特定需求做出選擇。這樣的純化方法在生物制藥和生物化學研究中得到了廣泛應用，以提取具有特定標簽的蛋白質，并保持其活性和結構完整性。

  蛋白質檢測

  除了純化多組氨酸標記的重組蛋白外，His標簽還具有多種其他應用：

  ELISA或WesternBlot檢測：

  您可以利用鎳螯合辣根過氧化物酶來促進基于HRP的His標記蛋白檢測，而無需使用抗體?；蛘?，您也可以使用對帶有組氨酸標簽的蛋白質具有高靈敏度和特異性的抗6xHis抗體。

  蛋白質相互作用分析：

  鎳瓊脂糖樹脂可用于純化、鑒定和測量His標記蛋白的相互作用物，從而幫助研究蛋白質間的相互作用。

  微孔板涂層：

  鎳或銅涂層微孔板可將粗或半純化樣品中的融合蛋白包被于各種板和報告基因檢測中，用于高通量的蛋白質檢測和篩選。

  凝膠染色：

  有幾種免疫分析方法利用多組氨酸標簽，通過抗多組氨酸標簽抗體或SDS-PAGE檢測目標蛋白，用于蛋白質的定性和定量分析。

  熒光標記：

  熒光六組氨酸標簽的開發(fā)使研究人員能夠更好地研究蛋白質的遷移和運輸，提供了一種可視化的方式來追蹤蛋白質在細胞中的動態(tài)過程。

  HIS標簽優(yōu)勢

  His標簽正逐漸成為分離純化蛋白質及其他生物工程產(chǎn)物最有效的技術之一，His標簽單克隆抗體可用于鑒定His標簽蛋白的表達情況（如目標蛋白的相對表達量、分子量）、在細胞內的位置等特性。

  His標簽是蛋白純化的首選，其優(yōu)點有：

  （1）N端His標簽與細菌的轉錄翻譯機制相兼容，有利于蛋白的表達；

  （2）采用IMAC（固定化金屬離子親和層析技術）純化His標簽融合蛋白更為方便；

  （3）His標簽對目的蛋白本身的特性幾乎不影響，不會改變目的蛋白本身的溶解性和生物學功能；

  （4）His標簽很小，一般不影響蛋白的功能，且融合蛋白結晶后對蛋白的結構沒有影響；

  （5）His標簽的免疫原性較低，純化的蛋白可直接注射入動物體內進行免疫和抗體制備；

  （6）與其他親和標簽構建成雙親和標簽，可適用于多種表達體系，純化條件溫和；His標簽融合蛋白應用范圍廣泛，可在非離子表面活性劑中純化，也可在變性條件下純化，前者通常用于純化疏水性較強的目的蛋白，而后者通常用于純化包涵體蛋白。

  His標簽通常存在以下問題：

  (1)由于宿主蛋白的非特異性結合導致靶標純度低

  （2）樣品或緩沖液成分干擾蛋白質結合

  （3）由于緩沖液成分不兼容，純化后蛋白質發(fā)生沉淀

  （4）哺乳動物細胞培養(yǎng)基干擾蛋白質結合或導致Ni2+泄漏

  （5）目標蛋白所需的pH值導致其從Ni-NTA瓊脂糖中洗脫

  （6）由于標簽-配體親和力和特異性較低，在蛋白質分析中的適用性有限

  為了避免或解決這些問題，需要仔細規(guī)劃流程并優(yōu)化His標簽純化方案。最終，His標簽可能仍無法達到令人滿意的結果，或者可能根本不適合某種類型的蛋白質。在這種情況下，應考慮使用不同的親和標簽。

  通過上文介紹，相信你對His標簽更了解，詳情的了解His標簽有助于后續(xù)實驗純化蛋白和檢測蛋白。純化蛋白和檢測蛋白在生物學研究和醫(yī)學應用中都具有重要的作用，它們?yōu)槲覀兩钊肓私馍飳W過程、疾病發(fā)生機制以及藥物研發(fā)提供了重要的實驗手段和技術支持。