酶聯(lián)免疫試劑盒的工作原理全解析

  酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)是一種常用的分析生化檢測(cè)，由Eva Engvall和Peter Perlmann于1971年首次描述。是一種固相類型的酶免疫測(cè)定(EIA)，使用酶聯(lián)免疫技術(shù)針對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)的抗體來檢測(cè)液體樣品中配體（通常是蛋白質(zhì)）的存在。ELISA已被用作醫(yī)學(xué)、植物病理學(xué)和生物技術(shù)的診斷工具，以及各個(gè)行業(yè)的質(zhì)量控制檢查。相關(guān)閱讀：《什么是酶聯(lián)免疫試劑盒》

  什么是酶聯(lián)免疫技術(shù)？

  酶聯(lián)免疫技術(shù)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA），1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。

酶聯(lián)免疫技術(shù)

  ELISA的類型

  ELISA可分為三種主要類型：夾心、間接和競爭。

  夾心ELISA

  首先，“捕獲”抗體與孔結(jié)合。然后，添加樣品后，僅“捕獲”抗體識(shí)別的蛋白質(zhì)。最后，使用第二檢測(cè)抗體進(jìn)行結(jié)合蛋白的檢測(cè)。檢測(cè)和捕獲抗體也稱為匹配抗體對(duì)或匹配對(duì)。最后，使用酶標(biāo)二抗檢測(cè)檢測(cè)抗體。

  間接ELISA

  在這種類型的ELISA中，蛋白質(zhì)樣品通過吸收直接結(jié)合到孔中。然后，使用稱為抗原的抗體檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的存在。在這種類型中，由于每個(gè)一抗中存在大量允許信號(hào)放大的表位，因此靈敏度增加。

  競爭性ELISA

  在這里，一抗的存在與樣品一起產(chǎn)生，形成復(fù)合物。當(dāng)復(fù)合物沉淀后，將二抗添加到孔中。僅當(dāng)抗原未與其結(jié)合時(shí)，一抗才能被識(shí)別。因此，可見二抗與抗原競爭。

  酶聯(lián)免疫試劑盒基本組成

  一個(gè)完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：

  1、已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；

  2、酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；

  3、酶的底物；陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品（定性），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量）；

  4、酶聯(lián)物（結(jié)合物）及樣本的稀釋液；

  5、’洗滌液；酶反應(yīng)終止液。

  酶聯(lián)免疫試劑盒原理

  酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA）是一種將抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)與酶催化反應(yīng)相結(jié)合的免疫分析方法。該方法的基本原理是將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然后加入酶標(biāo)記的二抗，形成酶標(biāo)抗原-抗體復(fù)合物。當(dāng)?shù)孜锶芤杭尤氲椒磻?yīng)體系中時(shí)，底物在酶的催化下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化。通過檢測(cè)顏色變化，可以確定是否存在待檢測(cè)的抗原或抗體。

  酶聯(lián)免疫試劑盒的應(yīng)用與優(yōu)勢(shì)

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)是應(yīng)用最廣泛的免疫測(cè)定類型之一，比RIA更安全、更容易。ELISA涉及使用酶活性作為檢測(cè)抗體-酶綴合物結(jié)合的手段。酶在其催化的反應(yīng)和其識(shí)別的底物方面具有特異性，并受到其他分子對(duì)其活性的調(diào)節(jié)。因此，由于酶的特異性和酶催化產(chǎn)生的擴(kuò)增現(xiàn)象，酶的使用可能是有利的。ELISA的檢測(cè)類型有所不同，當(dāng)酶標(biāo)記產(chǎn)生有色產(chǎn)物時(shí)，通常采用分光光度法；當(dāng)酶催化氧化還原化學(xué)反應(yīng)時(shí)，通常采用電化學(xué)法。ELISA的主要缺點(diǎn)是酶活性依賴于物理和化學(xué)環(huán)境。

  酶聯(lián)免疫試劑盒局限性和挑戰(zhàn)

  在使用酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行免疫測(cè)定實(shí)驗(yàn)過程，難免會(huì)出現(xiàn)一些問題，比如假陽性。這里上海通蔚生物為各位盤點(diǎn)了一下。

  假陽性結(jié)果的可能原因包括：

  1、交叉反應(yīng)：不同分子之間可能存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致非特異性信號(hào)的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

  2、樣本污染：樣本處理過程中的污染或者不潔凈的工作環(huán)境可能會(huì)引入外部干擾物質(zhì)，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

  3、操作不當(dāng)：操作過程中的技術(shù)不到位或者操作失誤，如試劑的過量使用、溫度控制不當(dāng)?shù)?，都可能?dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。

  4、試劑盒質(zhì)量：試劑盒的質(zhì)量問題，如存儲(chǔ)條件不當(dāng)、過期等，可能影響試劑盒的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

  假陰性結(jié)果的可能原因包括：

  1、抗體交叉反應(yīng)：ELISA試劑盒使用的抗體可能會(huì)與其他非目標(biāo)分子結(jié)合，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

  2、固相抗體和酶標(biāo)二抗的變構(gòu)：固相抗體和酶標(biāo)二抗可因其吸附及結(jié)合過程中抗體分子發(fā)生變構(gòu)，使Fc段的補(bǔ)體C1q結(jié)合點(diǎn)暴露出來，使C1q成為一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

  3、外源性干擾因素：如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本保存時(shí)間過長和標(biāo)本凝固不全等，都可能影響抗原與抗體的結(jié)合，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

  為了減少假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，可以采取以下措施：

  1、優(yōu)化試劑盒和實(shí)驗(yàn)條件：選擇質(zhì)量可靠的試劑盒，并嚴(yán)格按照說明書操作，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，降低假陽性或假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。

  2、嚴(yán)格控制樣本來源和處理過程：保證樣本的純凈性和完整性，避免樣本污染或者其他外部因素的干擾。

  3、增加質(zhì)控步驟：在實(shí)驗(yàn)過程中增加質(zhì)控步驟，監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題并進(jìn)行調(diào)整。

  4、合理選擇陽性和陰性對(duì)照：選擇適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫?duì)照，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

  5、多方驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如有條件，可以采用其他方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，提高數(shù)據(jù)的可信度和可靠性。

  希望大家可以通過上述方法避免ELISA實(shí)驗(yàn)帶來假陽性，假陰性溫度，最大化提高實(shí)驗(yàn)的效率。

  未來展望

  自1590年Zacharias Janssen和Hans Janssen發(fā)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡以來，實(shí)驗(yàn)室檢查經(jīng)歷了重大演變。Eva Engvall和Peter Perlman于1971年開發(fā)的ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）方法標(biāo)志著一個(gè)重要的里程碑在顯微實(shí)驗(yàn)室測(cè)試中。該方法為疾病診斷、生物研究、醫(yī)學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域做出了重大貢獻(xiàn)。在ELISA方法中，抗原、抗體和酶與底物之間的反應(yīng)發(fā)生在孔微孔板內(nèi)，并且可以通過分光光度法來測(cè)量結(jié)果。ELISA具有操作簡單、靈敏度高、效率好等優(yōu)點(diǎn)。然而，也存在一些挑戰(zhàn)，例如抗體制備成本高以及假陽性/陰性結(jié)果的可能性。盡管如此，ELISA仍然是當(dāng)今實(shí)驗(yàn)室檢查中最常用的方法之一，在疾病診斷、健康監(jiān)測(cè)和研究中有多種應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，預(yù)計(jì)未來ELISA方法將不斷發(fā)展，為提高醫(yī)療質(zhì)量和科學(xué)認(rèn)識(shí)做出更大的貢獻(xiàn)。