PCR實(shí)驗(yàn)室科學(xué) | 如何擴(kuò)增所需的目標(biāo)片段

  1983年，美國生物化學(xué)家卡里·穆利斯(Cary Mullis)提出了核酸體外擴(kuò)增的想法，并于1985年發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過程，從而誕生了PCR技術(shù)。1988年，Saiki等人成功地使用從植物中分離出來的耐熱DNA聚合酶自動(dòng)擴(kuò)增DNA DNA聚合酶使PCR變得更加方便，這使其成為一種通用的分子生物學(xué)技術(shù)。

  在傳統(tǒng)PCR技術(shù)在分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用時(shí)，常常出現(xiàn)樣本量小、樣本珍貴、非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象。非特異性擴(kuò)增可能由以下原因引起：常規(guī)設(shè)備DNA聚合酶的最佳溫度為72℃，此時(shí)酶活性最高，酶活性下降。此外，DNA聚合酶在低溫下被激活，導(dǎo)致錯(cuò)誤的引物序列延伸并形成引物二聚體。熱啟動(dòng)高保真酶也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，主要是由于PCR條件（Mg2+、退火溫度、循環(huán)次數(shù)），ETC）。非特異性可能導(dǎo)致：目標(biāo)擴(kuò)增子產(chǎn)量低、目標(biāo)擴(kuò)增子靈敏度降低、下游應(yīng)用效率低。

  今天上海通蔚將帶大家科學(xué)討論P(yáng)CR如何放大所需的目標(biāo)片段，通常方法如下：

  1、直接PCR

  直接PCR是指直接從樣品中擴(kuò)增靶DNA，無需分離或純化核酸。

  在高溫變性步驟中，細(xì)胞或組織等樣品在特殊配制的緩沖液中裂解，然后釋放DNA。直接PCR簡化了工作流程并減少了操作步驟。從而防止純化步驟中DNA丟失。菌落PCR鑒定是現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室直接PCR最典型的應(yīng)用。簡單處理或稀釋后的樣品可直接進(jìn)行PCR。

  2、梯度PCR

  梯度PCR和降落PCR都優(yōu)化反應(yīng)體系的退火溫度，但原理不同。

  梯度PCR用于不清楚退火溫度的情況。為確定最佳退火溫度，多管PCR同時(shí)運(yùn)行PCR儀一臺(tái)（需要支持設(shè)置梯度退火溫度的PCR儀）。將每個(gè)管放置在儀器內(nèi)的不同列或行中，并單獨(dú)運(yùn)行PCR（例如，對(duì)于50-60°C的溫度范圍，將6個(gè)管放置在50°C、52°C和54°C）C).C、56°C)、58°C和60°C，分別)。最后確定最佳退火溫度，并在此退火溫度下進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。

  3、降落PCR技術(shù)

  PCR系統(tǒng)的許多組件如引物、模板、Mg2+、dNTP等都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確?？赡馨l(fā)生。對(duì)于復(fù)雜的基因組DNA模板，傳統(tǒng)PCR常常伴隨非特異性擴(kuò)增，無法產(chǎn)生理想的目標(biāo)產(chǎn)物。為了解決PCR中非特異性擴(kuò)增的問題，Dong等人。1991年，他發(fā)明了降落PCR（TD-PCR）技術(shù)。

  降落PCR與梯度PCR相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，選擇合適的梯度PCR退火溫度需要多次反應(yīng)或多管反應(yīng)。其次，即使通過多次實(shí)驗(yàn)確定了最佳退火溫度，如果更換其他PCR設(shè)備并進(jìn)行相同的擴(kuò)增，最佳退火溫度也可能會(huì)發(fā)生變化。這時(shí)，需要重新確定最佳退火溫度。而降落PCR只需一次反應(yīng)即可獲得良好的擴(kuò)增效果，并且避免了對(duì)每對(duì)引物最佳復(fù)性溫度的優(yōu)化和確定。此外，降落PCR顯著緩解了儀器性能對(duì)擴(kuò)增效果的限制。

  原則

  PCR中的退火溫度會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果。隨著退火溫度升高，擴(kuò)增特異性增加，但擴(kuò)增效率降低。在降落PCR開始時(shí)，進(jìn)行高溫?cái)U(kuò)增以獲得特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。目的基因豐度增加后，降低擴(kuò)增溫度可提高擴(kuò)增效率。將退火溫度降低至發(fā)生非特異性擴(kuò)增的水平可為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物提供幾何優(yōu)勢(shì)。其余反應(yīng)中的非特異性位點(diǎn)由于豐度較低而無法與特異性位點(diǎn)競爭，獲得單一主要擴(kuò)增產(chǎn)物。

  退火溫度設(shè)定

  通常，降落PCR的退火溫度范圍為高于Tm值5°C至低于Tm值約10°C，最高可達(dá)15°C。在每個(gè)溫度下循環(huán)1至2次，然后在較低的退火溫度下循環(huán)10次。

  應(yīng)用

  Touchdown PCR適用于經(jīng)常更換引物的實(shí)驗(yàn)。Touchdown PCR可以讓您快速、特異地獲得所需的擴(kuò)增片段，而無需知道Tm值，也無需費(fèi)力確定最佳Tm值?，F(xiàn)在許多PCR儀器都包含設(shè)置降落PCR的程序，該程序廣泛用于研究。

  4、巢式PCR

  巢式PCR是PCR的一種變體。使用兩對(duì)PCR引物對(duì)（而不是單個(gè)引物）來擴(kuò)增特定片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段，與傳統(tǒng)PCR類似。第二對(duì)引物是嵌套引物（因?yàn)樗鼈兾挥诨蚯短自诘谝粋€(gè)片段內(nèi)），a>結(jié)合在第一個(gè)擴(kuò)增子內(nèi)并特異性擴(kuò)增第一個(gè)擴(kuò)增子內(nèi)的DNA片段。

  優(yōu)勢(shì)

  如果在第一次擴(kuò)增中產(chǎn)生了錯(cuò)誤的片段，該區(qū)域在第二輪中被第二對(duì)引物對(duì)擴(kuò)增的概率非常低。。因此，巢式PCR具有較高的擴(kuò)增特異性。

  實(shí)驗(yàn)過程

  步驟1：

         第一對(duì)引物（以綠色顯示）與DNA目標(biāo)模板結(jié)合。由于特異性不足，它還可能與具有相似結(jié)合位點(diǎn)的其他片段結(jié)合并擴(kuò)增靶標(biāo)。

第二步：使用第二對(duì)橙色引物與第一步擴(kuò)增的目標(biāo)片段結(jié)合，進(jìn)行第二次擴(kuò)增。這些引物嵌套在第一個(gè)PCR產(chǎn)物中，因此非特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物包含兩個(gè)引物對(duì)。它不太可能包含結(jié)合位點(diǎn)。這可以防止第二組引物擴(kuò)增非目標(biāo)片段。這種嵌套式PCR擴(kuò)增確保了第二次PCR擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物很少或沒有受到來自替代引物目標(biāo)序列的非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的污染。

上述是PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，為大家介紹實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的一些方法，這些方法是我在此領(lǐng)域?yàn)榇蠹铱偨Y(jié)的經(jīng)驗(yàn)，希望大家在實(shí)驗(yàn)過程可以根據(jù)自身的需求進(jìn)行選擇。上海通蔚有PCR試劑盒，如果您需要了解更多PCR試劑盒，歡迎咨詢。