PCR技術(shù)及其在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

  PCR已經(jīng)對生物學(xué)產(chǎn)生了變革性的影響，因?yàn)樗梢詫O少量的DNA擴(kuò)增到可以分析的數(shù)量。以前，增加DNA數(shù)量的唯一方法是利用細(xì)菌來產(chǎn)生更多副本。這個過程非常耗時，需要將DNA片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)?；蚱渌d體中，將組合的DNA引入細(xì)菌細(xì)胞，培養(yǎng)大量細(xì)菌，然后再次從細(xì)菌中純化DNA片段。使用PCR，可以快速大量生成特定的DNA序列，而無需將DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中來產(chǎn)生副本。這使得純化DNA片段變得更加容易。

  與生物體不同，PCR只能復(fù)制短DNA片段，通常長度不超過10千堿基對(kb)。有些技術(shù)可以復(fù)制長達(dá)40kb的片段，這仍然比真核細(xì)胞的染色體DNA短得多。例如，人類細(xì)胞有大約30億個堿基對，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過PCR可以復(fù)制的最大DNA長度。

  PCR已成為研究實(shí)驗(yàn)室中用于多種用途的必備工具，例如基因克隆、測序和測量基因表達(dá)。此外，它在醫(yī)學(xué)上還用于準(zhǔn)確識別微生物，包括單個病原體或多種生物群，例如腸道微生物群中的微生物。

  在醫(yī)學(xué)和生物研究實(shí)驗(yàn)室中，PCR是一種常用技術(shù)，用于各種目的，包括識別遺傳疾病、建立基因指紋、診斷傳染病、克隆基因、進(jìn)行親子鑒定和DNA計(jì)算。

  PCR過程如何進(jìn)行？

  PCR需要幾個基本組分的存在，包括：

  1.包含要擴(kuò)增的DNA片段的DNA模板或cDNA。

  2.兩個引物，用于識別要擴(kuò)增片段的起點(diǎn)和終點(diǎn)

  3.Taq聚合酶，它復(fù)制要擴(kuò)增的片段。

  4.核苷酸，是DNA聚合酶合成新DNA鏈的組成部分。

  5.緩沖溶液，為DNA聚合酶的功能提供適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)環(huán)境。

  PCR反應(yīng)在熱循環(huán)儀中進(jìn)行，熱循環(huán)儀是一種能夠精確加熱和冷卻其中的反應(yīng)管以達(dá)到每個反應(yīng)階段所需溫度的設(shè)備。為了防止反應(yīng)混合物蒸發(fā)，在反應(yīng)管頂部放置加熱蓋，或在反應(yīng)混合物表面添加一層油。

  在深入研究PCR過程之前，徹底了解其基本原理非常重要。PCR依靠四種核苷酸堿基，即腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥嘌呤，即使來自有限的來源，也能擴(kuò)增高質(zhì)量的DNA片段。通常，單個PCR循環(huán)涉及30-35次重復(fù)，大約需要兩個小時才能生成可用量的DNA片段。通過結(jié)合多重PCR、RT-PCR、嵌套PCR、反向PCR、菌落PCR、不對稱PCR、解旋酶PCR、連接介導(dǎo)PCR等細(xì)微變化，可以定制PCR以產(chǎn)生更好的結(jié)果。PCR反應(yīng)涉及20-40個循環(huán)，每個循環(huán)有三種不同的溫度。

  PCR每個循環(huán)包含三個關(guān)鍵步驟，包括變性、引物退火和最終延伸。

  變性

  PCR中的變性過程包括將DNA樣本加熱到95°C左右，通過破壞兩個互補(bǔ)堿基之間的氫鍵將雙鏈DNA分離為單鏈DNA。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中，此變性階段通常需要15-30秒。

  引物退火

  第二步稱為退火，溫度降低到60°C左右。這允許引物附著到DNA樣本中的互補(bǔ)序列上，并且溫度保持約15-60秒，具體取決于引物的長度。較長的引物與精確目標(biāo)序列的結(jié)合更特異性。退火溫度足夠低，以使引物堿基與目標(biāo)DNA形成氫鍵，并且它根據(jù)目標(biāo)DNA和引物的序列確定。

  最終延伸

  第三步是延伸或延長，此時溫度升高到所用熱穩(wěn)定DNA聚合酶的理想溫度，通常約為72°C。在此溫度下，DNA聚合酶使用核苷酸延伸或延長引物，從而產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA鏈。延伸階段的持續(xù)時間取決于目標(biāo)DNA的長度，目標(biāo)越長，DNA聚合酶需要的時間就越長，才能產(chǎn)生完整的副本。

  PCR在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

  PCR在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主要應(yīng)用之一是快速診斷。研究人員已經(jīng)能夠使用PCR快速識別HIV、單純皰疹病毒(HSV-2)等病毒以及白色念珠菌等真菌種類，幫助醫(yī)生比傳統(tǒng)檢測方法更快地確診。事實(shí)上，由于其靈活性和準(zhǔn)確性，PCR已成為識別臨床環(huán)境中相關(guān)病原體的不可或缺的工具。

  PCR的高靈敏度也使其在診斷罕見疾病時從其他實(shí)驗(yàn)室技術(shù)中脫穎而出，因?yàn)榕c疾病相關(guān)的基因突變可能僅發(fā)生在少數(shù)細(xì)胞中。

  除了檢測病原體，PCR還可用于通過量化mRNA水平來評估樣本中的基因表達(dá)水平。這可提供有關(guān)細(xì)胞健康的有用信息，并可幫助醫(yī)療專業(yè)人員診斷癌癥或嚴(yán)重疾病。

  在生物學(xué)研究領(lǐng)域，PCR仍然在世界各地的現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室中發(fā)揮著重要作用，因?yàn)樗梢陨钊肓私馍矬w如何進(jìn)化以及生物體如何相互作用。它還可用于分析以前未表征的基因或通路以及從群體中篩選突變體。由于其廣泛的實(shí)際應(yīng)用，自三十年前推出以來，無數(shù)科學(xué)家一直在使用PCR——使其成為當(dāng)今研究人員可以使用的最強(qiáng)大的分子工具之一。

  在研究和診斷中檢測DNA序列

  PCR一直是用于在研究和臨床診斷中檢測DNA序列的有力工具。從歷史上看，限制性酶使研究人員能夠檢測和分析各種基因異常，但PCR可以用更少的樣本材料提供更精確的結(jié)果。PCR確實(shí)存在一些缺點(diǎn)，在考慮將其用于特定應(yīng)用時必須權(quán)衡這些缺點(diǎn)。由于該方法依賴于獲取要擴(kuò)增的特定DNA序列，因此目標(biāo)序列內(nèi)的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)果無用或不準(zhǔn)確。此外，由于其特異性，應(yīng)始終使用其他檢測或測序方法（如桑格測序）進(jìn)一步確認(rèn)研究結(jié)果。但也許最重要的是考慮與其他方法相比的成本——有時根據(jù)可用資源，其他流程可能更合適。

  PCR在檢測DNA序列方面具有深遠(yuǎn)的意義，并且已被證明是推動研究和診斷發(fā)展的關(guān)鍵。這些進(jìn)步為更深入地了解遺傳組成和識別可能被忽視的疾病提供了巨大的機(jī)會。