PCR技術(shù)及其在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

  PCR已經(jīng)對生物學(xué)產(chǎn)生了變革性的影響，因?yàn)樗梢詫O少量的DNA擴(kuò)增到可以分析的數(shù)量。以前，增加DNA數(shù)量的唯一方法是利用細(xì)菌來產(chǎn)生更多副本。這個(gè)過程非常耗時(shí)，需要將DNA片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)?；蚱渌d體中，將組合的DNA引入細(xì)菌細(xì)胞，培養(yǎng)大量細(xì)菌，然后再次從細(xì)菌中純化DNA片段。使用PCR，可以快速大量生成特定的DNA序列，而無需將DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中來產(chǎn)生副本。這使得純化DNA片段變得更加容易。

  與生物體不同，PCR只能復(fù)制短DNA片段，通常長度不超過10千堿基對(kb)。有些技術(shù)可以復(fù)制長達(dá)40kb的片段，這仍然比真核細(xì)胞的染色體DNA短得多。例如，人類細(xì)胞有大約30億個(gè)堿基對，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過PCR可以復(fù)制的最大DNA長度。

  PCR已成為研究實(shí)驗(yàn)室中用于多種用途的必備工具，例如基因克隆、測序和測量基因表達(dá)。此外，它在醫(yī)學(xué)上還用于準(zhǔn)確識(shí)別微生物，包括單個(gè)病原體或多種生物群，例如腸道微生物群中的微生物。

  在醫(yī)學(xué)和生物研究實(shí)驗(yàn)室中，PCR是一種常用技術(shù)，用于各種目的，包括識(shí)別遺傳疾病、建立基因指紋、診斷傳染病、克隆基因、進(jìn)行親子鑒定和DNA計(jì)算。

  PCR過程如何進(jìn)行？

  PCR需要幾個(gè)基本組分的存在，包括：

  1.包含要擴(kuò)增的DNA片段的DNA模板或cDNA。

  2.兩個(gè)引物，用于識(shí)別要擴(kuò)增片段的起點(diǎn)和終點(diǎn)

  3.Taq聚合酶，它復(fù)制要擴(kuò)增的片段。

  4.核苷酸，是DNA聚合酶合成新DNA鏈的組成部分。

  5.緩沖溶液，為DNA聚合酶的功能提供適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)環(huán)境。

  PCR反應(yīng)在熱循環(huán)儀中進(jìn)行，熱循環(huán)儀是一種能夠精確加熱和冷卻其中的反應(yīng)管以達(dá)到每個(gè)反應(yīng)階段所需溫度的設(shè)備。為了防止反應(yīng)混合物蒸發(fā)，在反應(yīng)管頂部放置加熱蓋，或在反應(yīng)混合物表面添加一層油。

  在深入研究PCR過程之前，徹底了解其基本原理非常重要。PCR依靠四種核苷酸堿基，即腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥嘌呤，即使來自有限的來源，也能擴(kuò)增高質(zhì)量的DNA片段。通常，單個(gè)PCR循環(huán)涉及30-35次重復(fù)，大約需要兩個(gè)小時(shí)才能生成可用量的DNA片段。通過結(jié)合多重PCR、RT-PCR、嵌套PCR、反向PCR、菌落PCR、不對稱PCR、解旋酶PCR、連接介導(dǎo)PCR等細(xì)微變化，可以定制PCR以產(chǎn)生更好的結(jié)果。PCR反應(yīng)涉及20-40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)有三種不同的溫度。

  PCR每個(gè)循環(huán)包含三個(gè)關(guān)鍵步驟，包括變性、引物退火和最終延伸。

  變性

  PCR中的變性過程包括將DNA樣本加熱到95°C左右，通過破壞兩個(gè)互補(bǔ)堿基之間的氫鍵將雙鏈DNA分離為單鏈DNA。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中，此變性階段通常需要15-30秒。

  引物退火

  第二步稱為退火，溫度降低到60°C左右。這允許引物附著到DNA樣本中的互補(bǔ)序列上，并且溫度保持約15-60秒，具體取決于引物的長度。較長的引物與精確目標(biāo)序列的結(jié)合更特異性。退火溫度足夠低，以使引物堿基與目標(biāo)DNA形成氫鍵，并且它根據(jù)目標(biāo)DNA和引物的序列確定。

  最終延伸

  第三步是延伸或延長，此時(shí)溫度升高到所用熱穩(wěn)定DNA聚合酶的理想溫度，通常約為72°C。在此溫度下，DNA聚合酶使用核苷酸延伸或延長引物，從而產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA鏈。延伸階段的持續(xù)時(shí)間取決于目標(biāo)DNA的長度，目標(biāo)越長，DNA聚合酶需要的時(shí)間就越長，才能產(chǎn)生完整的副本。

  PCR在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

  PCR在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主要應(yīng)用之一是快速診斷。研究人員已經(jīng)能夠使用PCR快速識(shí)別HIV、單純皰疹病毒(HSV-2)等病毒以及白色念珠菌等真菌種類，幫助醫(yī)生比傳統(tǒng)檢測方法更快地確診。事實(shí)上，由于其靈活性和準(zhǔn)確性，PCR已成為識(shí)別臨床環(huán)境中相關(guān)病原體的不可或缺的工具。

  PCR的高靈敏度也使其在診斷罕見疾病時(shí)從其他實(shí)驗(yàn)室技術(shù)中脫穎而出，因?yàn)榕c疾病相關(guān)的基因突變可能僅發(fā)生在少數(shù)細(xì)胞中。

  除了檢測病原體，PCR還可用于通過量化mRNA水平來評估樣本中的基因表達(dá)水平。這可提供有關(guān)細(xì)胞健康的有用信息，并可幫助醫(yī)療專業(yè)人員診斷癌癥或嚴(yán)重疾病。

  在生物學(xué)研究領(lǐng)域，PCR仍然在世界各地的現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室中發(fā)揮著重要作用，因?yàn)樗梢陨钊肓私馍矬w如何進(jìn)化以及生物體如何相互作用。它還可用于分析以前未表征的基因或通路以及從群體中篩選突變體。由于其廣泛的實(shí)際應(yīng)用，自三十年前推出以來，無數(shù)科學(xué)家一直在使用PCR——使其成為當(dāng)今研究人員可以使用的最強(qiáng)大的分子工具之一。

  在研究和診斷中檢測DNA序列

  PCR一直是用于在研究和臨床診斷中檢測DNA序列的有力工具。從歷史上看，限制性酶使研究人員能夠檢測和分析各種基因異常，但PCR可以用更少的樣本材料提供更精確的結(jié)果。PCR確實(shí)存在一些缺點(diǎn)，在考慮將其用于特定應(yīng)用時(shí)必須權(quán)衡這些缺點(diǎn)。由于該方法依賴于獲取要擴(kuò)增的特定DNA序列，因此目標(biāo)序列內(nèi)的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)果無用或不準(zhǔn)確。此外，由于其特異性，應(yīng)始終使用其他檢測或測序方法（如桑格測序）進(jìn)一步確認(rèn)研究結(jié)果。但也許最重要的是考慮與其他方法相比的成本——有時(shí)根據(jù)可用資源，其他流程可能更合適。

  PCR在檢測DNA序列方面具有深遠(yuǎn)的意義，并且已被證明是推動(dòng)研究和診斷發(fā)展的關(guān)鍵。這些進(jìn)步為更深入地了解遺傳組成和識(shí)別可能被忽視的疾病提供了巨大的機(jī)會(huì)。