選擇抗體和考慮濃度的要點

  在計劃使用抗體的實驗時，必須選擇并確定要使用的抗體類型及其濃度等條件。另外，如有必要，請考慮使用二抗。那么，我們在選擇抗體和確定條件時具體應(yīng)該關(guān)注哪些點呢？

  本文總結(jié)了選擇和使用一抗時需要考慮的要點、如何調(diào)整濃度以及使用時如何選擇二抗。如果詳細(xì)了解一抗和二抗可以參考《科研實驗必備知識：一抗與二抗的區(qū)別》

  選擇和使用抗體時應(yīng)考慮的事項

  確定目標(biāo)分子（抗原）并選擇檢測方法后，選擇檢測目標(biāo)的一抗。如果針對目標(biāo)分子有不止一種抗體可用，則使用多種抗體進(jìn)行主要實驗可能會更好。選擇抗體時請考慮以下幾點。

  一、用于研究的應(yīng)用

•   并非所有抗體都適用于每種應(yīng)用。
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•   確定您想要進(jìn)行的測定是定性的還是定量的。
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•   檢查供應(yīng)商的數(shù)據(jù)表或網(wǎng)站，了解抗體是否適合您的特定應(yīng)用，例如免疫印跡或 ELISA。

  二、待測樣品類型

•   感興趣的組織或細(xì)胞是否表達(dá)特定的蛋白質(zhì)？
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•   您想要檢測的蛋白質(zhì)是潛在的還是活躍的？例如，磷酸化特異性抗體可能僅與活化的磷酸化蛋白質(zhì)反應(yīng)。
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•   如果感興趣的蛋白質(zhì)位于細(xì)胞內(nèi)，則可能需要裂解部分或全部細(xì)胞。
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•   流式細(xì)胞術(shù)分析可能需要使用識別細(xì)胞表面分子的抗體。
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•   如果感興趣的蛋白質(zhì)具有 3D 結(jié)構(gòu)并且表位不清楚，則其天然狀態(tài)下的抗體將無法識別，并且樣品必須變性。
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•   有些抗體僅在冷凍標(biāo)本或未固定的組織中發(fā)揮良好作用。其他抗體在抗原修復(fù)步驟后對石蠟包埋切片起作用。

  三、待檢測蛋白質(zhì)的來源物種

•   選擇抗體時，您通常選擇一種針對從感興趣物種獲得的免疫原而產(chǎn)生的抗體。
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•   如果用于產(chǎn)生抗體的免疫原不是來自感興趣的物種，請檢查它是否與感興趣的樣品發(fā)生反應(yīng)。您可以在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中快速檢查特定蛋白質(zhì)的序列。

  四、用于抗體生產(chǎn)的物種

  該信息在選擇二抗時非常有用。二抗在系統(tǒng)發(fā)育上應(yīng)盡可能遠(yuǎn)離樣本來源的物種。

  五、檢查數(shù)據(jù)表和驗證數(shù)據(jù)

•   檢查供應(yīng)商網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)表和驗證數(shù)據(jù)并考慮數(shù)據(jù)的質(zhì)量。
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•   檢查是否僅測試了抗原的存在或不存在（ELISA、蛋白質(zhì)印跡）或是否有其他詳細(xì)數(shù)據(jù)。
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•   了解正在測試的樣品類型（細(xì)胞裂解物、組織勻漿等）。如果僅使用純化的重組蛋白，則實際的細(xì)胞或組織樣品可能無法獲得最佳結(jié)果。

  六、技術(shù)服務(wù)和支持

•   檢查賣家是否有任何保證，例如退款或積分。
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•   了解可以獲得哪些類型的技術(shù)支持。擁有實際的技術(shù)支持比網(wǎng)站上的常見問題解答 (FAQ) 更好。

  如何調(diào)節(jié)抗體滴度和濃度

  抗體-抗原結(jié)合的強(qiáng)度取決于結(jié)合常數(shù)，其在溫度、pH、溶劑成分等的影響下發(fā)生變化?？乖?/span>-抗體復(fù)合物的形成也可以通過改變?nèi)芤褐锌贵w和抗原的相對濃度來控制。

  抗體濃度和滴度不是同義詞。濃度是溶液中所含抗體的總量。通常，活性、功能性抗體總量中只有一小部分具有結(jié)合抗原的能力。但這個功能部分決定了它的有效性。效價是指在免疫測定中使用抗體時發(fā)生反應(yīng)的最大稀釋度。換句話說，它表示即使抗體-血清溶液被稀釋，仍然觀察到可檢測量的抗體的程度。

  在大多數(shù)情況下，無法調(diào)整樣品中抗原的濃度。因此，必須針對每個特定的實驗條件憑經(jīng)驗確定抗體的最佳工作濃度（稀釋度）。

  對于任何測定，最佳滴度是產(chǎn)生最強(qiáng)的陽性測試響應(yīng)和最小的背景響應(yīng)的濃度（稀釋度）。必須為每次測定確定最佳抗體濃度。通常使用稀釋系列進(jìn)行判斷。

  確定最佳抗體濃度的最佳方法如下。首先，選擇固定的孵育時間并制備和測試一系列稀釋液。稀釋因子通常表示為較濃縮的儲備溶液與所需溶液總量的比率。例如，將 1 份抗體儲備液與 9 份稀釋液混合，總共 10 份，制備 1:10 的抗體稀釋液。

  數(shù)據(jù)表或方案還可能推薦與抗體一起使用的適當(dāng)稀釋度。然而，當(dāng)首次使用抗體或使用新批次時，建議使用稀釋系列來確定所用抗體的最佳稀釋度。

  例如，如果產(chǎn)品數(shù)據(jù)表建議使用 1:500 稀釋度，則可以針對特定的檢測條件使用 1:50、1:100、1:500、1:1,000 和 1:10,000 的稀釋度。幫助確定最佳稀釋率。

  特別是對于多克隆抗血清，不同動物或一種血清樣品與另一種血清樣品之間的抗體濃度可能存在顯著差異。因此，這種早期滴定對于減少測定間變異至關(guān)重要。

  什么是二抗？

  二抗通常用于間接檢測一抗所結(jié)合的抗原。因此，選擇對一抗的物種或同種型具有特異性并與可檢測標(biāo)簽或標(biāo)記偶聯(lián)的二抗非常重要。

  

二抗原理

  可檢測的標(biāo)簽包括酶和熒光染料。常用的標(biāo)簽有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）、異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明、德克薩斯紅、藻紅蛋白（PE）和生物素。

  當(dāng)沒有可用的標(biāo)記一抗或一抗未用所需酶或熒光染料標(biāo)記時，使用二抗。

  二抗也用于提高檢測靈敏度。盡管使用二抗需要額外的步驟，但優(yōu)點是多個二抗與單個一抗結(jié)合，從而放大信號并提高靈敏度。

  正確選擇二抗可改善染色效果并最大限度地減少假陽性或陰性。

  二抗是通過使用不同物種的抗體對宿主動物進(jìn)行免疫來產(chǎn)生的。例如，抗山羊抗體是通過將山羊抗體注射到山羊以外的動物體內(nèi)來產(chǎn)生的。同樣，如果一抗是在小鼠中產(chǎn)生的，那么二抗必須是在另一個物種（山羊、驢等）中產(chǎn)生的抗小鼠抗體。

  大多數(shù)一抗屬于 IgG 類。這些抗體可以通過適當(dāng)?shù)目?IgG 二抗來檢測。如果一抗是 IgM，則必須選擇 IgM 特異性二抗。

  如何選擇合適的二抗

  二抗必須針對產(chǎn)生一抗的同一物種。例如，如果一抗是在山羊中產(chǎn)生的，則二抗必須是抗山羊抗體。

  根據(jù)您的專業(yè)知識和實驗室可用的設(shè)備選擇所需的熒光染料或酶聯(lián)抗體。最常用的熒光染料標(biāo)記包括熒光素、羅丹明、德克薩斯紅和藻紅蛋白。酶標(biāo)記包括辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。

  酶聯(lián)抗體是 ELISA 檢測的良好選擇。熒光染料偶聯(lián)的二抗最適合用于流式細(xì)胞術(shù)。

  生物素標(biāo)記的抗體比用熒光染料或酶標(biāo)記的二抗更敏感，并提供放大的信號。

  為了獲得更好的結(jié)果，請使用預(yù)吸附有與樣品相同物種的血清的二抗。這減少了背景。然而，此類預(yù)吸附抗體識別表位的能力降低，可能無法識別某些 IgG 亞類。

  二抗有兩種：用蛋白 A 等純化血清而得到的“IgG 級分二抗”和僅純化以下抗體而得到的“親和純化二抗”。通過親和純化與目標(biāo)分子發(fā)生反應(yīng)。親和純化二抗的優(yōu)點是非特異性結(jié)合最小化。然而，如果它含有高親和力的抗體，則很難從柱上洗脫，因此 IgG 級分可能是優(yōu)選的。如果抗原的含量非常低，則 IgG 組分可能更合適。

  選擇與一抗類別或亞類相匹配的二抗。例如，如果一抗是小鼠 IgM，則使用抗小鼠 IgM 二抗。如果小鼠單克隆一抗的類別或亞類未知，可以使用識別大多數(shù)小鼠 IgG 亞型的抗小鼠 IgG。

  以上，我們講解了一抗的選擇和使用要點，如何調(diào)整濃度，以及如何選擇二抗。記住這些要點并創(chuàng)建適合您的目的和目標(biāo)的實驗計劃。