ELISA 與蛋白質(zhì)印跡：兩種常見免疫測(cè)定法的比較

  在生物醫(yī)學(xué)研究中，"免疫測(cè)定"一詞是常用術(shù)語(yǔ)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室工作人員來(lái)說，免疫測(cè)定有不同類型是常識(shí)。

  什么是免疫測(cè)定？

  免疫測(cè)定是一種借助抗體-抗原相互作用或反應(yīng)來(lái)評(píng)估給定溶液中大分子的存在和濃度的技術(shù)。

  在我們之前的一些文章中，我們重點(diǎn)介紹了兩種免疫測(cè)定法——ELISA 和蛋白質(zhì)印跡——廣泛用作蛋白質(zhì)濃度分析的生物分析方法。鑒于兩者具有相似的目的，即使對(duì)于最熟練的實(shí)驗(yàn)室專家來(lái)說，兩者之間的選擇也是一個(gè)挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)印跡法和 Elisa 法哪個(gè)更好？– 迄今為止，對(duì)于大多數(shù)科研人員來(lái)說，這是一個(gè)重要的困境。

  在本文中，上海通蔚通過強(qiáng)調(diào)這兩種生化技術(shù)的差異并比較它們?cè)趯?shí)驗(yàn)室應(yīng)用中的可用性和適用性，讓您深入了解這兩種生化技術(shù)。我們希望這些信息能夠消除您的疑慮并回答您有關(guān)該主題的所有問題。

  什么是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定？

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA) 是一種經(jīng)濟(jì)有效的分析工具，通常用于分析抗體、抗原、蛋白質(zhì)和糖蛋白。ELISA 是免疫測(cè)定的黃金標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度高，是一種測(cè)量尿液、血清或細(xì)胞培養(yǎng)物等各種樣品中蛋白質(zhì)存在情況的簡(jiǎn)單方法。Elisas 還有助于廣泛應(yīng)用的細(xì)胞因子分析，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病的分析。

圖1 elisa

  目前，elisa方法分為4種類型，分別包括：

  1、直接elisa

  2、間接elisa

  3、夾心elisa

  4、競(jìng)爭(zhēng)elisa

  在 ELISA 方法中，樣品中的抗原附著在聚苯乙烯板上。使用與酶結(jié)合的相同抗體來(lái)使抗原與其結(jié)合。洗滌后，從板上除去所有未結(jié)合的抗體，并在洗滌后應(yīng)用酶底物。當(dāng)發(fā)生結(jié)合時(shí)，這種酶底物會(huì)產(chǎn)生可見信號(hào)，例如顏色變化。

  Elisa優(yōu)缺點(diǎn)

  一、Elisa優(yōu)點(diǎn)：

  1、Elisa 方法最適合檢測(cè)極少量、稀有或低豐度的目標(biāo)蛋白。

  2、Elisa 免疫分析高度靈敏，可以測(cè)量樣品中目標(biāo)蛋白的精確含量。

  3、該技術(shù)對(duì)于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度或監(jiān)測(cè)一段時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)水平的變化非常有用。

  4、ELISA 可以非?？焖俚靥峁└咄?，易于執(zhí)行，并且?guī)缀醪恍枰獮楦鞣N應(yīng)用準(zhǔn)備樣品。因此，對(duì)于時(shí)間緊迫的實(shí)驗(yàn)室專家來(lái)說，這種方法是日常或定期進(jìn)行檢測(cè)的便捷選擇。

  5、Elisa 檢測(cè)具有成本效益。

  二、Elisa缺點(diǎn)：

  1、傳統(tǒng)上，一種 Elisa 檢測(cè)只能靶向一種蛋白質(zhì)，因此不可能進(jìn)行多重檢測(cè)。因此，同時(shí)分析單個(gè)樣品中的多種蛋白質(zhì)變得很困難。

  2、ELISA 檢測(cè)的靈敏度范圍有限。

  3、除了目標(biāo)分子之外，Elisa 測(cè)定中使用的抗體還可以結(jié)合相似或結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子。這可能導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，并影響測(cè)定的準(zhǔn)確性、可靠性和特異性。

  4、Elisa 檢測(cè)有時(shí)會(huì)干擾樣品基質(zhì)，從而導(dǎo)致靈敏度或特異性降低。

  5、ELISA 檢測(cè)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化可能是一個(gè)限制。

  什么是蛋白質(zhì)印跡技術(shù)？

  蛋白質(zhì)印跡程序是廣泛用于蛋白質(zhì)分析的最典型的細(xì)胞和分子生物學(xué)程序之一。蛋白質(zhì)印跡法也稱為蛋白質(zhì)免疫印跡法，有助于確定給定樣品中特定蛋白質(zhì)的存在、大小和數(shù)量。蛋白質(zhì)印跡步驟包括：

圖2 蛋白質(zhì)印跡

  1）按尺寸分離，

  2) 轉(zhuǎn)移到固體支持物或膜上，并且

  3) 使用適當(dāng)?shù)囊豢购投箻?biāo)記目標(biāo)蛋白以進(jìn)行可視化。

  蛋白質(zhì)印跡原理

  蛋白質(zhì)印跡分析依賴于聚丙烯凝膠電泳和抗體的使用。該技術(shù)允許研究人員使用電泳（充當(dāng)分子篩）根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和類型從凝膠狀樣品中分離和識(shí)別蛋白質(zhì)。

   然后分離的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到膜上，其中每個(gè)蛋白質(zhì)形成一條帶。然后用標(biāo)記的抗體處理膜，這些抗體針對(duì)所需的蛋白質(zhì)以產(chǎn)生彩色條帶。可以鑒定這些抗體，并且可以根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ諄?lái)分析結(jié)合蛋白的大小和豐度。

  蛋白質(zhì)印跡優(yōu)缺點(diǎn)

  一、蛋白質(zhì)印跡優(yōu)點(diǎn)：

  1、使用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，可以從具有相似特性或尺寸的細(xì)胞中提取的復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中分離出單個(gè)蛋白質(zhì)。

  2、蛋白質(zhì)印跡非常適合分析復(fù)雜的混合物，例如細(xì)胞裂解物，并且可以檢測(cè)目標(biāo)蛋白水平較低的樣品中的特定目標(biāo)蛋白。

  3、該技術(shù)可以利用蛋白質(zhì)大小、豐度、分子量等因素以及了解蛋白質(zhì)表達(dá)模式、研究蛋白質(zhì)修飾以及研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和雜質(zhì)所必需的信息來(lái)確認(rèn)蛋白質(zhì)。

  4、蛋白質(zhì)印跡可用于蛋白質(zhì)表達(dá)水平的定量分析。

  5、蛋白質(zhì)印跡具有多種用途，因?yàn)樗梢允褂枚喾N樣品類型，包括細(xì)胞裂解物、組織、血液和其他生物液體。

  6、蛋白質(zhì)印跡法通常用作驗(yàn)證技術(shù)來(lái)驗(yàn)證從其他測(cè)定（例如 ELISA 或質(zhì)譜法）獲得的結(jié)果。

  二、蛋白質(zhì)印跡缺點(diǎn)：

  1、蛋白質(zhì)印跡可以提供相對(duì)蛋白質(zhì)豐度的估計(jì)，這使其成為一種半定量技術(shù)而不是絕對(duì)定量方法。

  2、蛋白質(zhì)大小的分辨率可能受到限制，特別是對(duì)于具有相似分子量的蛋白質(zhì)。

  3、蛋白質(zhì)印跡對(duì)樣品的變異性和復(fù)雜性很敏感。

  4、與 Elisa 檢測(cè)一樣，蛋白質(zhì)印跡中使用的抗體可能會(huì)表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性，與非預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)合或產(chǎn)生非特異性信號(hào)，導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果并影響數(shù)據(jù)解釋。

  5、蛋白質(zhì)印跡可能并不總能提供蛋白質(zhì)修飾的全面分析。

  6、蛋白質(zhì)印跡涉及凝膠電泳、蛋白轉(zhuǎn)移、封閉、抗體孵育和信號(hào)檢測(cè)等多個(gè)步驟，耗時(shí)、費(fèi)力且成本高昂。

  7、蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的解釋可能是主觀的，特別是在比較相對(duì)線強(qiáng)度時(shí)，并且需要經(jīng)過訓(xùn)練的眼睛。

  ELISA 與蛋白質(zhì)印跡對(duì)比

  現(xiàn)在我們知道了這兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和局限性，我們比較下表中的主要差異。

特征	elisa	蛋白質(zhì)印跡
原理	酶標(biāo)記免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）	蛋白質(zhì)分離和免疫檢測(cè)
檢測(cè)對(duì)象	液態(tài)樣品（例如血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清）	細(xì)胞提取物、組織提取物
靈敏度	通常具有較高的靈敏度，可檢測(cè)低至pg/mL水平的蛋白質(zhì)	可以非常靈敏地檢測(cè)特定蛋白質(zhì)
多樣性	可以用于檢測(cè)多種蛋白質(zhì)，需要有對(duì)應(yīng)的抗體	可以檢測(cè)多個(gè)蛋白質(zhì)，但需要進(jìn)行多輪實(shí)驗(yàn)
自動(dòng)化程度	可以進(jìn)行高通量分析，并且有許多商業(yè)化的自動(dòng)化系統(tǒng)可供選擇	較難進(jìn)行高通量分析，通常需要手工操作
耗時(shí)	可以在幾小時(shí)內(nèi)完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)	實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要一天或更長(zhǎng)時(shí)間
成本	相對(duì)較低，ELISA試劑盒的成本較低	儀器和試劑成本較高

  據(jù)觀察，這兩種技術(shù)都可以檢測(cè)和定量蛋白質(zhì)，各有優(yōu)缺點(diǎn)。我們希望這些信息可以幫助您就最適合您的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)或應(yīng)用的方法做出更明智的決定。