競爭性 ELISA法詳解

  競爭性 ELISA法是一種用于估計樣本（例如血清）中存在的抗體的技術(shù)。原理如下：

  1.其原理是使用兩種特異性抗體，一種與酶結(jié)合，另一種存在于檢測血清中（如果血清抗體呈陽性）。

  2.兩種抗體之間會發(fā)生針對相同抗原的競爭。

  3.出現(xiàn)顏色表明測試呈陰性（不存在抗體），而沒有顏色則表明測試呈陽性（存在抗體）。

  4.競爭性 ELISA 的是原始抗原（樣品抗原）和添加抗原執(zhí)行的競爭性結(jié)合過程。

  5.其他形式的 ELISA 相比，競爭性 ELISA 的程序在某些方面有所不同。

  競爭性 ELISA 的步驟

  1.一抗（未標(biāo)記）與樣品抗原一起孵育。

  2.然后將抗體-抗原復(fù)合物添加到預(yù)先涂有相同抗原的孔板中。

  3.通過清洗板去除未結(jié)合的抗體。（樣品中的抗原越多，能夠與孔中的抗原結(jié)合的抗體就越少，因此“競爭”。）

  4.添加對一抗具有特異性并與酶綴合的二抗。

  5.添加底物，其余酶引發(fā)顯色或熒光信號。

  競爭性 ELISA結(jié)果

  1.在此檢測中，微量滴定孔涂有抗原。

  2.將待測血清添加到這些孔中并在 37°C 下孵育，然后洗滌。

  3.如果測試血清中存在抗體，則會發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。

  4.通過添加酶標(biāo)記特異性抗體來檢測抗原抗體反應(yīng)。

  5.在陽性測試中，沒有留下任何抗原供這些抗體發(fā)揮作用。因此，抗體保持游離狀態(tài)并在洗滌過程中被洗掉。

  6.添加底物后，沒有酶可以對其起作用。因此，沒有顏色反應(yīng)表明陽性結(jié)果。

  7.在陰性測試中，血清中不存在抗體，包被孔中的抗原可與酶結(jié)合的抗體結(jié)合，酶作用于底物產(chǎn)生顏色。

  競爭性 ELISA的優(yōu)點

  1.高特異性，因為使用了兩種抗體并且特異性捕獲和檢測抗原/分析物

  2.適用于復(fù)雜樣品，因為抗原在測量前不需要純化

  3.靈活性和靈敏度，因為可以使用直接和間接檢測方法

  競爭性 ELISA實驗方案

  對于大多數(shù)應(yīng)用，聚氯乙烯 (PVC) 微量滴定板是最好的。

  1.將 50 μL 稀釋的一抗（捕獲）添加到每個微量滴定孔中。孵育 4 小時。室溫或 4°C 過夜。

  注意：如果沒有純化的捕獲抗體，則應(yīng)首先根據(jù)以下步驟用針對捕獲抗體宿主的純化二抗包被板：

•   通過向每個孔中添加約 50 μL 抗體溶液（磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 中的 20 μg/mL），將未標(biāo)記的二抗結(jié)合到每個孔的底部。
•   將板在 4°C 下孵育過夜，以實現(xiàn)完全結(jié)合。
•   添加一抗（如上所述）。

  2.用 PBS 清洗孔兩次。可以通過將板輕拂到合適的容器上來去除抗體溶液洗液。

  3.微量滴定板上剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點必須通過與封閉緩沖液一起孵育來飽和。用 3% BSA/PBS 和 0.02% 疊氮化鈉將孔填充到頂部。孵育2小時。至室溫下在潮濕氣氛中過夜。

  4.用 PBS 洗孔兩次。

  5.將 50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液添加至孔中。所有稀釋均應(yīng)在封閉緩沖液（3% BSA/PBS 和 0.05% Tween-20）中進(jìn)行。

  注意： 疊氮化鈉是辣根過氧化物酶的抑制劑。如果使用 HRP 標(biāo)記的綴合物進(jìn)行檢測，請勿在緩沖液或洗滌溶液中加入疊氮化鈉。

  6.將 50 μL 抗原結(jié)合物溶液添加到孔中（應(yīng)滴定抗原溶液）。所有稀釋均應(yīng)在封閉緩沖液（3% BSA/PBS 和 0.05% Tween-20）中進(jìn)行。孵育至少 2 小時。在室溫潮濕的氣氛中。

  7.用 PBS 將板洗四次。

  8.添加基材。經(jīng)過建議的孵育時間后，可以在 ELISA 讀數(shù)器上測量目標(biāo)波長的光密度。

最后，上述競爭性 ELISA法僅供參考，每個廠家elisa試劑盒不同，具體的可以詳情參考說明書。文中只是給大家詳細(xì)介紹一下elisa實驗具體的方案。