競爭性 ELISA法詳解

  競爭性 ELISA法是一種用于估計樣本（例如血清）中存在的抗體的技術。原理如下：

  1.其原理是使用兩種特異性抗體，一種與酶結合，另一種存在于檢測血清中（如果血清抗體呈陽性）。

  2.兩種抗體之間會發(fā)生針對相同抗原的競爭。

  3.出現(xiàn)顏色表明測試呈陰性（不存在抗體），而沒有顏色則表明測試呈陽性（存在抗體）。

  4.競爭性 ELISA 的是原始抗原（樣品抗原）和添加抗原執(zhí)行的競爭性結合過程。

  5.其他形式的 ELISA 相比，競爭性 ELISA 的程序在某些方面有所不同。

  競爭性 ELISA 的步驟

  1.一抗（未標記）與樣品抗原一起孵育。

  2.然后將抗體-抗原復合物添加到預先涂有相同抗原的孔板中。

  3.通過清洗板去除未結合的抗體。（樣品中的抗原越多，能夠與孔中的抗原結合的抗體就越少，因此“競爭”。）

  4.添加對一抗具有特異性并與酶綴合的二抗。

  5.添加底物，其余酶引發(fā)顯色或熒光信號。

  競爭性 ELISA結果

  1.在此檢測中，微量滴定孔涂有抗原。

  2.將待測血清添加到這些孔中并在 37°C 下孵育，然后洗滌。

  3.如果測試血清中存在抗體，則會發(fā)生抗原抗體反應。

  4.通過添加酶標記特異性抗體來檢測抗原抗體反應。

  5.在陽性測試中，沒有留下任何抗原供這些抗體發(fā)揮作用。因此，抗體保持游離狀態(tài)并在洗滌過程中被洗掉。

  6.添加底物后，沒有酶可以對其起作用。因此，沒有顏色反應表明陽性結果。

  7.在陰性測試中，血清中不存在抗體，包被孔中的抗原可與酶結合的抗體結合，酶作用于底物產生顏色。

  競爭性 ELISA的優(yōu)點

  1.高特異性，因為使用了兩種抗體并且特異性捕獲和檢測抗原/分析物

  2.適用于復雜樣品，因為抗原在測量前不需要純化

  3.靈活性和靈敏度，因為可以使用直接和間接檢測方法

  競爭性 ELISA實驗方案

  對于大多數應用，聚氯乙烯 (PVC) 微量滴定板是最好的。

  1.將 50 μL 稀釋的一抗（捕獲）添加到每個微量滴定孔中。孵育 4 小時。室溫或 4°C 過夜。

  注意：如果沒有純化的捕獲抗體，則應首先根據以下步驟用針對捕獲抗體宿主的純化二抗包被板：

•   通過向每個孔中添加約 50 μL 抗體溶液（磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 中的 20 μg/mL），將未標記的二抗結合到每個孔的底部。
•   將板在 4°C 下孵育過夜，以實現(xiàn)完全結合。
•   添加一抗（如上所述）。

  2.用 PBS 清洗孔兩次?？梢酝ㄟ^將板輕拂到合適的容器上來去除抗體溶液洗液。

  3.微量滴定板上剩余的蛋白質結合位點必須通過與封閉緩沖液一起孵育來飽和。用 3% BSA/PBS 和 0.02% 疊氮化鈉將孔填充到頂部。孵育2小時。至室溫下在潮濕氣氛中過夜。

  4.用 PBS 洗孔兩次。

  5.將 50 μL 標準品或樣品溶液添加至孔中。所有稀釋均應在封閉緩沖液（3% BSA/PBS 和 0.05% Tween-20）中進行。

  注意： 疊氮化鈉是辣根過氧化物酶的抑制劑。如果使用 HRP 標記的綴合物進行檢測，請勿在緩沖液或洗滌溶液中加入疊氮化鈉。

  6.將 50 μL 抗原結合物溶液添加到孔中（應滴定抗原溶液）。所有稀釋均應在封閉緩沖液（3% BSA/PBS 和 0.05% Tween-20）中進行。孵育至少 2 小時。在室溫潮濕的氣氛中。

  7.用 PBS 將板洗四次。

  8.添加基材。經過建議的孵育時間后，可以在 ELISA 讀數器上測量目標波長的光密度。

最后，上述競爭性 ELISA法僅供參考，每個廠家elisa試劑盒不同，具體的可以詳情參考說明書。文中只是給大家詳細介紹一下elisa實驗具體的方案。