二辛可寧酸 (BCA) 蛋白質(zhì)檢測(cè)：材料、步驟及關(guān)鍵技巧

  蛋白質(zhì)定量是許多生物研究和工業(yè)過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。準(zhǔn)確測(cè)量蛋白質(zhì)濃度對(duì)于各種應(yīng)用至關(guān)重要，例如研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、評(píng)估酶活性以及確定下游分析的蛋白質(zhì)濃度。二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定因其高靈敏度、重現(xiàn)性以及與各種樣品類型的兼容性而成為廣泛使用的蛋白質(zhì)定量方法。

  二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定原理

  二辛可寧酸（BCA）蛋白質(zhì)測(cè)定法是一種廣泛使用的定量測(cè)定樣品中總蛋白質(zhì)的方法。BCA測(cè)定依賴于在堿性條件下，蛋白質(zhì)將Cu2?離子還原為Cu?離子。隨后，生成的Cu?離子與BCA試劑反應(yīng)，形成一種吸收562nm波長(zhǎng)光的紫色絡(luò)合物。使用分光光度計(jì)測(cè)量該絡(luò)合物的吸光度。生成的絡(luò)合物的量與樣品中蛋白質(zhì)的含量成正比，因此通過(guò)測(cè)量吸光度可以間接確定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。

  為什么要進(jìn)行二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定？

  二辛可寧酸（BCA）蛋白質(zhì)測(cè)定是一種可靠且靈敏的定量測(cè)定樣品中總蛋白質(zhì)的方法。它比Bradford測(cè)定更靈敏，能夠檢測(cè)低至0.5μg/mL的蛋白質(zhì)濃度。BCA測(cè)定對(duì)非蛋白質(zhì)來(lái)源的干擾具有更高的耐受性，例如去污劑、還原劑和脂質(zhì)，這些物質(zhì)可能會(huì)干擾其他蛋白質(zhì)測(cè)定方法。由于其高靈敏度和對(duì)干擾物質(zhì)的耐受性，BCA測(cè)定廣泛應(yīng)用于生化研究、生物技術(shù)和臨床診斷中，用于定量各種樣品類型（例如血清、血漿和細(xì)胞裂解物）中的總蛋白質(zhì)。相關(guān)閱讀：8種蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)方法詳解

  二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定方案

  材料：

  BCA工作試劑（見(jiàn)下方配方）

  BSA標(biāo)準(zhǔn)品（見(jiàn)下方配方）

  蛋白質(zhì)樣品

  96孔微孔板

  酶標(biāo)儀

  BCA工作試劑配方：

  BCA試劑A：含有50mg/mL二辛可寧酸的2%碳酸鈉溶液

  BCA試劑B：含有4%硫酸銅的0.4N氫氧化鈉溶液

  將50份BCA試劑A與1份BCA試劑B混合，混勻后在室溫下孵育30分鐘備用。

  BSA標(biāo)準(zhǔn)品配方：

  將10mgBSA溶解在10mL蒸餾水中，制成1mg/mL儲(chǔ)備液。制備一系列已知濃度范圍為0至2mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用蒸餾水進(jìn)行稀釋。

  程序：

  1、將50份BCA試劑A和1份BCA試劑B混合，制備BCA工作試劑。混勻后在室溫下孵育30分鐘備用。

  2、制備一系列已知濃度范圍為0至2mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用蒸餾水進(jìn)行稀釋。

  3、將10μL每種BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液和蛋白質(zhì)樣品分別移入96孔微孔板的單獨(dú)孔中。

  4、向每個(gè)孔中添加200μLBCA工作試劑。

  5、通過(guò)輕輕移液或搖動(dòng)板子充分混合。

  6、在37°C下孵育板子30分鐘。

  7、孵育后，將板子冷卻至室溫。

  8、使用酶標(biāo)儀在562nm處測(cè)量吸光度。最好在反應(yīng)停止后30分鐘內(nèi)讀取吸光度。

  9、使用BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

  10、使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)濃度。

  成功進(jìn)行二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)檢測(cè)的技巧：

  1、確保BCA工作試劑在使用前充分混合。

  2、使用不含蛋白質(zhì)的樣品作為空白對(duì)照來(lái)校準(zhǔn)微孔板讀數(shù)儀。

  3、使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，因?yàn)樗哂忻鞔_的結(jié)構(gòu)并且在溶液中穩(wěn)定。

  4、使用蒸餾水制備所有溶液并稀釋蛋白質(zhì)樣品。

  5、避免蛋白質(zhì)樣品中含有高濃度的去垢劑或還原劑，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾測(cè)定。

  二辛可寧酸（BCA）蛋白質(zhì)測(cè)定法是一種可靠且靈敏的定量方法，適用于各種科研領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)檢測(cè)。本方案詳細(xì)介紹了BCA試劑的配方、標(biāo)準(zhǔn)品的制備以及具體的操作步驟，并提供了一些成功進(jìn)行檢測(cè)的技巧。這些指導(dǎo)不僅能幫助科研人員在實(shí)驗(yàn)中獲得準(zhǔn)確和一致的結(jié)果，還能減少由于干擾物質(zhì)引起的測(cè)定誤差。通過(guò)遵循上述方案，科研人員能夠高效地進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，從而支持進(jìn)一步的生化研究和應(yīng)用。希望本指南能為您的科研工作提供實(shí)質(zhì)性的幫助。