ELISA檢測(cè)試劑盒：原理、步驟和操作指南

  elisa檢測(cè)試劑盒簡(jiǎn)稱(chēng)“酶聯(lián)免疫試劑盒”簡(jiǎn)稱(chēng)，它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。1971年– PeterPerlman和EvaEngvall開(kāi)發(fā)了一種革命性的方法，稱(chēng)為ELISA（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）。ELISA技術(shù)自七十年代初問(wèn)世以來(lái)，發(fā)展十分迅速，目前廣泛生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。

  如今elisa檢測(cè)試劑盒具有 靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡(jiǎn)便性、安全性及經(jīng)濟(jì)性等受到科研好評(píng)。接下來(lái)上海通蔚帶大家詳細(xì)了解一下elisa實(shí)驗(yàn)原理及步驟。

  ELISA原理

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）是一種使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定的免疫測(cè)定法，用于檢測(cè)和定量生物分子，例如抗體、蛋白質(zhì)、激素或肽，以及表征蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-核酸相互作用。

  在ELISA實(shí)驗(yàn)中，用于實(shí)驗(yàn)的靶標(biāo)（如抗原）固定在固體表面上，然后使用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的酶綴合抗體進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)與被酶催化的底物孵育來(lái)實(shí)現(xiàn)定量，從而產(chǎn)生可測(cè)量的副產(chǎn)物。

  由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。目前，elisa試劑盒檢測(cè)方法有直接 ELISA、間接 ELISA、夾心 ELISA 和競(jìng)爭(zhēng) ELISA 等。

  直接ELISA法

  在直接ELISA中，抗原通過(guò)被動(dòng)吸附直接固定在板（聚苯乙烯微孔板上）的表面，然后使用蛋白質(zhì)（例如抑肽酶、卵清蛋白、BSA或任何其他動(dòng)物蛋白）封閉微孔板，洗滌板并與一抗一起孵育。并使用HRP標(biāo)記的一抗進(jìn)行檢測(cè)。將無(wú)色底物引入樣品，該底物與酶結(jié)合物反應(yīng)，并產(chǎn)生可測(cè)量的副產(chǎn)物。該副產(chǎn)物可以是比色的，化學(xué)發(fā)光的或熒光的。

圖1 直接ELISA

  由于elisa直接法步驟較少，適用于實(shí)驗(yàn)室工作流程的快速技術(shù)，同時(shí)還消除了二抗交叉反應(yīng)，其缺點(diǎn)是靈敏度較低，成本較高。

  間接ELISA法

  間接ELISA法是在直接ELISA上改進(jìn)的版本。在間接ELISA中，用于檢測(cè)抗原的一抗是未偶聯(lián)的。間接ELISA工作流程要涉及到兩種類(lèi)型抗體：一抗和二抗。取而代之的是，對(duì)一抗的宿主物種具有反應(yīng)性的酶標(biāo)二級(jí)抗體被用于檢測(cè)一抗-抗原復(fù)合物（間接檢測(cè)抗原）。將無(wú)色底物引入樣品，該底物與酶結(jié)合物反應(yīng)，并產(chǎn)生可測(cè)量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇，該副產(chǎn)物可以是比色的，化學(xué)發(fā)光的或熒光的。

圖2 間接ELISA

  間接ELISA的優(yōu)點(diǎn)是成本較低、更加靈敏和靈活。然而，由于二抗的存在，檢測(cè)過(guò)程中存在交叉反應(yīng)的可能性。

  夾心ELISA法

夾心elisa法也叫“三明治法”，它需要使用匹配的抗體對(duì)，從而每種抗體對(duì)抗原上不同的非重疊表位具有特異性。首先將一種抗體，稱(chēng)為捕獲抗體，包被在多孔微量滴定板的表面上，以促進(jìn)靶抗原的固定。然后，第二種抗體（稱(chēng)為檢測(cè)抗體）與捕獲抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合。最后，添加對(duì)檢測(cè)抗體（而非捕獲抗體）具有特異性的酶標(biāo)記的第二抗體偶聯(lián)物。

圖3 夾心ELISA

  夾心ELISA具有最高的靈敏度，但其主要缺點(diǎn)是該過(guò)程所需的時(shí)間和費(fèi)用。此外，尋找完美抗原抗體對(duì)的必要性也是該測(cè)定的限制。

  競(jìng)爭(zhēng)ELISA法

  競(jìng)爭(zhēng)elisa法檢測(cè)樣品中抗原特異性抗體的存在。將特異性抗體吸附于固相載體，加入待測(cè)抗原（標(biāo)準(zhǔn)品或樣本）和生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗原，二者競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)溫育和徹底洗滌后加入顯色底物。顯色的深淺與樣品中待測(cè)物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。

  競(jìng)爭(zhēng)elisa法不能用于經(jīng)過(guò)任何程度稀釋的樣品，并且靈敏度較低。然而，它有許多優(yōu)點(diǎn)，例如需要較少的樣品純化、較小的變異性以及分析樣品中的一系列抗原。

  Elisa檢測(cè)試劑盒組成及選擇

  Elisa檢測(cè)試劑盒組成

  Elisa檢測(cè)試劑盒組成通常包含酶標(biāo)板（Microplate）、標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）、生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體(DetectedAntibody)、洗滌液(WashingBuffer)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(HRP-Streptavidin)和顯色底物(TMB)。

圖4 elisa試劑盒組成

  Elisa檢測(cè)試劑盒選擇

  ELISA實(shí)驗(yàn)的成敗，很大程度上取決于試劑盒的選擇。面對(duì)眾多品牌和種類(lèi)，如何挑選合適的試劑盒呢？以下六個(gè)關(guān)鍵要素為你指明方向：

  1、供應(yīng)種屬

  一個(gè)ELISA試劑盒，多個(gè)種屬，如果您需對(duì)不同物種的同一因子進(jìn)行定量，建議優(yōu)先尋找適用于多個(gè)種屬的ELISA試劑盒，產(chǎn)品屬性說(shuō)明中會(huì)注明。Elis試劑盒種屬有羊、雞、鴨、人、大鼠、小鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、兔子、豬、犬、猴、馬、牛等動(dòng)物。

  2、明確樣本的類(lèi)型

  首先，您需要確定要檢測(cè)的分析物的樣本的類(lèi)型。夾心ELISA最適合檢測(cè)具有眾多表位的巨大蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞因子。而競(jìng)爭(zhēng)性ELISA主要用于檢測(cè)小分子，例如半抗原。

  大多數(shù)市售ELISA試劑盒均已在培養(yǎng)物上清液和血清/血漿上進(jìn)行了驗(yàn)證。正確閱讀產(chǎn)品說(shuō)明和說(shuō)明非常重要。這確保了該試劑盒適合需要分析的樣品。

  血漿樣本的采集方式會(huì)極大地影響試劑盒類(lèi)型的選擇，進(jìn)而影響所獲得的結(jié)果。

  其他因素，例如溶血和樣品制備中存在的脂質(zhì)，可能會(huì)影響測(cè)定性能。在選擇ELISA試劑盒之前，請(qǐng)確保充分注意這些因素。

  抗體類(lèi)型

  您可以聯(lián)系ELISA試劑盒供應(yīng)商，獲取有關(guān)試劑盒中使用的抗體類(lèi)型的信息。它將幫助您確定它是單克隆抗體還是多克隆抗體。對(duì)于夾心ELISA，使用多克隆抗體捕獲抗體和使用單克隆抗體檢測(cè)抗體是有益的。

  線(xiàn)性和回收率實(shí)驗(yàn)

  您可以進(jìn)行回收率和線(xiàn)性實(shí)驗(yàn)來(lái)監(jiān)測(cè)ELISA試劑盒的性能?；厥章蕼y(cè)試分析樣品基質(zhì)中存在的變化對(duì)分析物檢測(cè)的影響。據(jù)觀(guān)察，如果該值較高，則恢復(fù)效果更好。

  稀釋線(xiàn)性分析特定稀釋劑中分析物的劑量響應(yīng)線(xiàn)性。在理想情況下，所有稀釋度的樣品濃度都是相同的。

  很多時(shí)候，供應(yīng)商在產(chǎn)品規(guī)格中給出了回收率和線(xiàn)性數(shù)據(jù)。除此之外，為了更清楚起見(jiàn)，還提到了其他關(guān)鍵參數(shù)，例如動(dòng)態(tài)范圍和靈敏度。不同制造商提供的ELISA試劑盒可能具有不同的數(shù)據(jù)參數(shù)。要選擇合適的ELISA試劑盒，您可以分析所有數(shù)據(jù)參數(shù)，尤其是線(xiàn)性和回收率數(shù)據(jù)。

  系統(tǒng)所用檢測(cè)范圍

  ELISA中可用的各種檢測(cè)系統(tǒng)包括比色法、發(fā)光法和熒光法。所有ELISA試劑盒都包括一定水平的分析物阻塞，包括應(yīng)用酶標(biāo)記和類(lèi)似底物。選擇合適的酶和相同的底物至關(guān)重要。此外，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇交叉反應(yīng)的酶底物、檢測(cè)設(shè)備和微孔板。

  文獻(xiàn)引用數(shù)

  好的產(chǎn)品，肯定經(jīng)得起廣大科研工作者的檢驗(yàn)，ELISA試劑盒文獻(xiàn)引用特別是高質(zhì)量的SCI文章的引用是很多人都關(guān)心的問(wèn)題，這是業(yè)界對(duì)產(chǎn)品認(rèn)可的一個(gè)非常重要指標(biāo)，而且對(duì)相關(guān)用戶(hù)的科研有一定的借鑒作用。

  Elisa檢測(cè)試劑盒基本步驟

  Elisa檢測(cè)試劑盒基本步驟分包被、溫育、洗滌和測(cè)量，詳細(xì)如下：

  包被酶標(biāo)板。將酶標(biāo)板（微孔板）的孔位用特定的抗體或抗原進(jìn)行包被，以便后續(xù)的檢測(cè)。

  加樣。將標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品加入酶標(biāo)板的孔中。這可能包括稀釋樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。在加樣時(shí)，應(yīng)避免觸及孔壁，并輕輕晃動(dòng)混勻。

  溫育。用封板膜封閉酶標(biāo)板后，將其放置在特定溫度下進(jìn)行溫育，以便樣本與孔內(nèi)的抗體或抗原充分反應(yīng)。

  洗滌。溫育后，用洗滌液徹底清洗孔位，去除未結(jié)合的物質(zhì)。

  加酶標(biāo)記抗體。向孔中加入與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的酶標(biāo)記抗體，形成免疫復(fù)合物。

  再次洗滌。去除未結(jié)合的酶標(biāo)記抗體。

  顯色和終止反應(yīng)。加入底物溶液使酶標(biāo)記抗體產(chǎn)生顯色或熒光反應(yīng)。隨后加入停止液以停止反應(yīng)。

  測(cè)量。使用酶標(biāo)儀或熒光分析儀測(cè)量各孔的信號(hào)強(qiáng)度，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度確定待測(cè)物質(zhì)的濃度。

  常用的ELISA檢測(cè)方法

  在ELISA中，經(jīng)常使用與特定抗原結(jié)合的標(biāo)記抗體。因此，當(dāng)將能夠轉(zhuǎn)化酶的底物添加到反應(yīng)混合物中時(shí)，會(huì)引起溶液顏色的變化。使用檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)或分析信號(hào)。

  根據(jù)酶和底物的不同，ELISA檢測(cè)中的檢測(cè)方法差異很大。如今，還有許多ELISA試劑盒可讓您輕松進(jìn)行ELISA測(cè)定。但是，它不包含執(zhí)行檢測(cè)所需的通用試劑，例如tween-20、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、封閉緩沖液、洗滌緩沖液等。

  目前有許多檢測(cè)方法可用于研究抗原抗體復(fù)合物之間的反應(yīng)，例如比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法和顯色法。然而，下面介紹了其中最常見(jiàn)的三種。

  化學(xué)發(fā)光分析

  該技術(shù)利用過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的檢測(cè)抗體，例如HRP和AP?；隰斆字Z的溶液用作形成反應(yīng)產(chǎn)物的底物，發(fā)射光子，可以使用光度計(jì)讀取光子。

  與其他檢測(cè)方法相比，該技術(shù)具有超靈敏性，具有更寬的動(dòng)態(tài)范圍，甚至可以檢測(cè)給定樣品中最少量的分析物。

  顯色測(cè)定

  顯色法是ELISA檢測(cè)方法中最常見(jiàn)的類(lèi)型之一。它涉及使用辣根過(guò)氧化物酶(HRP-)或堿性磷酸酶(AP-)標(biāo)記的抗體與顯色底物（例如四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液）結(jié)合使用。

  該技術(shù)利用反應(yīng)的吸光度來(lái)確定讀數(shù)，用于比較樣品或根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)檢測(cè)感興趣分子的濃度。

  熒光分析

  該技術(shù)將過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的檢測(cè)抗體（例如HRP和AP）與暴露于某些光波長(zhǎng)時(shí)發(fā)出熒光的熒光底物相結(jié)合。即使分析物濃度較高，信號(hào)也不會(huì)飽和，并提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。

  上述為大家介紹了elisa檢測(cè)試劑盒原理和步驟，具體操作步驟要結(jié)合自己的實(shí)驗(yàn)需求和說(shuō)明進(jìn)行操作。由于ELISA方法具有敏感、快速、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于檢測(cè)中，對(duì)于科研，了解和操作ELISA實(shí)驗(yàn)是非常重要的。