三分鐘帶您理解PCR - 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

  什么是PCR？PCR也叫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在體外迅速擴(kuò)增DNA片斷的技術(shù)。它能夠以及少量DNA為模版，在幾小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增出上百萬(wàn)份DNA拷貝。PCR可以用于表達(dá)載體的構(gòu)，如基因重組，病原體檢測(cè)和基因檢測(cè)。

  為了獲得龐大的拷貝量，PCR一般需要經(jīng)歷三十多輪循環(huán)，在每輪循環(huán)過(guò)程中，都需要經(jīng)歷變性、復(fù)性和延伸三個(gè)步驟。每個(gè)步驟分別需要溫控、DNA母鏈、20至30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的引物、耐高溫的DNA聚合酶以及四種脫氧核酸苷酸ATCG。

  這5大要素中，首先是變性階段。當(dāng)溫度上升到90度時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈，溫度下降到50度左右時(shí)，進(jìn)入復(fù)興階段。

  我們需要使用兩種引物，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，此時(shí)需要大家提前留意各個(gè)單鏈以及引物的方向。

  以 5' 到 3' 是DNA復(fù)制始終遵循的正方向，3' 至 5' 是DNA單鏈。與3' 至 5'的引物想結(jié)合，也稱正向引物，反之， 5' 到 3' 是DNA單鏈與3' 至 5'引物想結(jié)合，稱反向引物。

  最后延伸開始，溫度上升到七十二度左右時(shí)，耐高溫的Taq酶，就四種脫氧核酸苷酸添加引物的 3'端。

  在PCR中，引物之所以稱之為引物，是因?yàn)樗?guī)定和引導(dǎo)了復(fù)制開始的方向，也就是說(shuō)，DNA每次的復(fù)制都必須從引物的 3'端開始，沿著引物自身 5' 到 3'的方向進(jìn)行延伸。有趣的是引物模版中間的某個(gè)部位開始引導(dǎo)復(fù)制，所以在第一輪結(jié)束時(shí)，一對(duì)新產(chǎn)生的DNA雙鏈中，存在不同長(zhǎng)度的單鏈。至此，本輪翻譯結(jié)束。

  接下來(lái)第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模版在經(jīng)過(guò)之前的三個(gè)步驟產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物。

同樣的，DNA依然能夠從引物的3'端開始復(fù)制，又形成了新的不同長(zhǎng)度的單鏈。我們發(fā)現(xiàn)進(jìn)入第三輪反應(yīng)后，在前兩次正向、反向引物的夾擊復(fù)制下，第一次形成了兩隊(duì)等長(zhǎng)的短雙鏈DNA，既兩端僅帶引物序列的目的基因片段。接下來(lái)，依據(jù)DNA半保留復(fù)制的原則，這樣的短雙鏈DNA呈指數(shù)擴(kuò)增。

上述是PCR擴(kuò)增原理的說(shuō)明，大家僅供參考！具體大家可以在實(shí)驗(yàn)中去理解每個(gè)步驟原理的情況。

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