免疫檢測實驗：標(biāo)記物類型介紹

  抗體標(biāo)記，或?qū)⑻囟?biāo)記附著到抗體上以幫助檢測或分離/純化蛋白質(zhì)，是一項重要的技術(shù)。標(biāo)記抗體對于蛋白質(zhì)印跡、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)(IHC)和免疫熒光(IF)等基于免疫的測定至關(guān)重要。標(biāo)記抗體還用于從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離和純化單一蛋白質(zhì)。與其他蛋白質(zhì)一樣，抗體可以用小分子、放射性同位素、酶蛋白和熒光染料標(biāo)記。

  傳統(tǒng)上，通常采用兩種不同的化學(xué)方法來標(biāo)記與小分子共價的抗體：

  1.該標(biāo)記與伯胺發(fā)生反應(yīng)，用于標(biāo)記抗體分子中的賴氨酸殘基

  2.抗體鏈內(nèi)的二硫鍵被還原，然后與硫醇反應(yīng)性標(biāo)記發(fā)生反應(yīng)

  目前，已經(jīng)開發(fā)出更新的方法，包括將標(biāo)記非共價添加到抗體的Fc部分，或?qū)?biāo)記共價添加到抗體重鏈的N連接聚糖上。使用的標(biāo)記物類型取決于下游應(yīng)用。終點將關(guān)注抗體的非放射性標(biāo)記及其用途。下文總結(jié)了不同免疫測定中使用的標(biāo)記類型。

  生物素標(biāo)記

  生物素是一種小分子，其結(jié)合親和素（存在于蛋清中）和鏈霉親和素（由鏈霉菌鏈霉菌產(chǎn)生）形成自然界中最強的非共價相互作用之一。由于其大小，生物素很少破壞抗體的活性，使其成為標(biāo)記物的不錯選擇。

  生物素標(biāo)記抗體用于蛋白質(zhì)印跡、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光和免疫組織化學(xué)，當(dāng)抗原難以檢測時，通常采用生物素標(biāo)記抗體來提高測定的靈敏度。通常，印跡或樣品與生物素標(biāo)記的抗體一起孵育，然后與用酶或熒光染料標(biāo)記的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行第二次孵育。抗體通常與多個生物素分子（3-6個分子）綴合，從而產(chǎn)生擴增步驟，從而增強對豐度較低的抗原的檢測。雖然生物素標(biāo)記物可以改善檢測，但它可能難以用于蛋白質(zhì)的分離/純化，因為生物素和（鏈霉）親和素之間的強相互作用可能難以破壞。

  許多公司銷售生物素化試劑盒，其中含有反應(yīng)性生物素分子，可輕松標(biāo)記蛋白質(zhì)。通常，通過使用生物素類似物的N-羥基琥珀酰亞胺酯將抗體標(biāo)記在賴氨酸的ε-氨基上。生物素使用至少6個原子的間隔臂附著在蛋白質(zhì)上，以防止下游操作過程中的空間障礙。間隔臂的長度和成分可以不同，以優(yōu)化測定。

  酶標(biāo)記

  傳統(tǒng)上，Western、ELISA和IHC最常用的抗體標(biāo)記是酶標(biāo)記。酶標(biāo)記比生物素大，但它們很少破壞抗體功能。最常用的酶標(biāo)記是辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶。

  要使用酶標(biāo)記抗體，將樣品與酶特異性底物一起孵育，酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物（顯色測定）或光（化學(xué)發(fā)光測定）。每種酶都有一組可用的底物和檢測方法。例如，HRP可以與二氨基聯(lián)苯胺反應(yīng)產(chǎn)生棕色產(chǎn)物，或與魯米諾反應(yīng)產(chǎn)生光。相比之下，AP可以與對硝基苯磷酸酯（pNPP）反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物（通過分光光度計檢測）或與5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）和硝基藍(lán)四唑（NBT）反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物紫色沉淀。顯色測定可用于蛋白質(zhì)印跡、ELISA和IHC，而生光反應(yīng)最常用于蛋白質(zhì)印跡。許多具有不同靈敏度和輸出的底物可用于檢測，使酶報告基因成為最流行的抗體標(biāo)記之一。

  盡管報道酶也與賴氨酸的ε-氨基綴合，但由于酶含有賴氨酸并且具有多聚化的潛力，因此可以采用額外的化學(xué)方法。酶標(biāo)記二抗可通過多家公司廣泛獲得，而其他公司則銷售用于在實驗室中標(biāo)記抗體的試劑盒。

  熒光標(biāo)記

  實驗室中熒光標(biāo)記抗體的使用正在穩(wěn)步增加。由于熒光染料直接與抗體綴合，因此檢測不需要酶/底物或結(jié)合相互作用。因此，檢測到的熒光信號量與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比。熒光標(biāo)記用于熒光Western測定、流式細(xì)胞術(shù)和IF，可用于高度定量測定。

  為了檢測熒光標(biāo)記，需要一種儀器來發(fā)射激發(fā)熒光染料的指定波長的光。然后熒光染料發(fā)出不同波長的信號。同一儀器包含適當(dāng)?shù)倪^濾器，用于檢測熒光染料的發(fā)射。流式細(xì)胞術(shù)需要使用流式細(xì)胞儀，而IF則使用熒光顯微鏡。數(shù)字成像系統(tǒng)通常用于蛋白質(zhì)印跡?？贵w可以用具有不同激發(fā)和發(fā)射光譜的多種熒光染料標(biāo)記。除了高度定量之外，熒光標(biāo)記還具有獨特的優(yōu)勢，即通過使用具有不重疊發(fā)射光譜的染料，能夠同時檢測兩種或多種不同的目標(biāo)蛋白。

  對于標(biāo)記，熒光標(biāo)記物可以通過伯胺或硫醇基團共價連接到抗體上。熒光標(biāo)記的抗體可以從許多公司購買，或者可以使用商業(yè)試劑盒在實驗室中標(biāo)記抗體。