酶聯(lián)免疫試劑盒：夾心ELISA

  酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是一種分析生物化學(xué)技術(shù)，能夠檢測和量化可溶性物質(zhì)，例如肽、蛋白質(zhì)、抗體和激素。本文上海通蔚詳細(xì)為您介紹下夾心ELISA法。

  ELISA優(yōu)勢很多，可以有效處理大量的樣本。這些高度特異性和靈敏的檢測可以檢測出低至每毫升0.01納克的抗原或抗體濃度。在ELISA實驗過程中，抗原-抗體復(fù)合物被固定在固體表面上。酶與復(fù)合物中的一個分子共價連接，添加酶特異性底物會產(chǎn)生可量化的有色反應(yīng)產(chǎn)物。

  在進(jìn)行ELISA實驗過程，選擇合適的ELISA類型非常重要，常見的ELISA類型有直接ELISA、間接ELISA、競爭ELISA和夾心ELISA法等。其中夾心ELISA法為檢測目標(biāo)分析物提供了無與倫比的靈敏度和特異性。相關(guān)閱讀：《elisa試劑盒有哪幾種類型？elisa四類型圖解》

  夾心ELISA法

  直接夾心ELISA通過將抗原捕獲在兩種特異性抗體之間來檢測抗原。夾心法ELISA主要組成如下：

  1.微孔板：通常為96孔板，根據(jù)檢測結(jié)果具有高結(jié)合力或中等結(jié)合力。

  2.捕獲抗體：特定蛋白質(zhì)結(jié)合的單克隆、多克隆或重組抗體。

  3.包被緩沖液：通常使用碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（pH9.6）或PBS（pH7.4）用于蛋白質(zhì)吸附。

  4.樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液：抗原或其他目標(biāo)蛋白。ELISA的常見樣品類型是血清、血漿、細(xì)胞上清液、尿液、唾液、組織勻漿和腦脊液。

  5.封閉緩沖液：牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉或商業(yè)封閉溶液，以防止非特異性結(jié)合。

  6.檢測抗體：與捕獲抗體結(jié)合到目標(biāo)抗原上的不同表位并且是酶偶聯(lián)的（例如辣根過氧化物酶，HRP）單克隆、多克隆或重組抗體。

  7.底物溶液：HRP的TMB（3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）或其他酶的合適底物。

  8.終止液：通常為1N硫酸（用于TMB）。

  9.洗滌緩沖液：含Tween-20（0.05%）的PBS或Tris緩沖鹽水(TBS)。

  10.移液器和吸頭：用于精確測量體積。

  11.平板讀取器：用于檢測吸光度或熒光。

  夾心ELISA法流程

  步驟1：涂覆板材

  首先用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中濃度為1-10μg/mL的捕獲抗體包被微量滴定板的孔。應(yīng)用抗體后，將微量滴定板在4°C下孵育過夜，使抗體吸附到孔中。

  第2步：阻斷

  去除包被溶液后，通過向每個孔中添加封閉緩沖液（例如PBS中的1%BSA）來封閉剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。將板在室溫下孵育1-2小時或在4°C下孵育過夜，以防止非特異性結(jié)合。去除封閉緩沖液并用PBS清洗3-5次，以幫助去除任何未結(jié)合的封閉劑。這是降低后續(xù)步驟中非特異性結(jié)合可能性的關(guān)鍵。

  為什么要阻斷？包被ELISA板是一種被動結(jié)合過程，其中生物分子被固定在孔表面上。如果不進(jìn)行封閉，抗原或檢測抗體可能會非特異性地與板結(jié)合，導(dǎo)致背景高和靈敏度低。封閉會使自由結(jié)合位點飽和，從而防止非特異性相互作用。使用比反應(yīng)體積（100μl）更高的封閉體積（200μl）可確保全面覆蓋。

  步驟3：添加樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

  向每個孔中添加100μL稀釋樣品（例如血漿、血清或細(xì)胞裂解物）。確保樣品在稀釋或封閉緩沖液中適當(dāng)稀釋，濃度在測定的預(yù)期動態(tài)范圍內(nèi)（通常在1-100ng/mL之間）。將板在37°C下孵育90分鐘或在4°C下孵育過夜。

  ELISA控制的重要性是什么？包括陽性和陰性對照對于驗證檢測的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。陽性對照可確認(rèn)檢測工作正常，而陰性對照可提醒您注意假陽性或非特異性結(jié)合。

  步驟4：清洗

  在每個步驟之間，特別是在與樣品和抗體一起孵育后，用PBS清洗培養(yǎng)皿幾次以去除任何未結(jié)合的物質(zhì)。

  步驟5：添加檢測抗體

  每孔加入100μL（通常為0.1-1μg/mL）稀釋的偶聯(lián)檢測抗體，室溫孵育2小時。務(wù)必用PBS清洗板3-5次，以去除未結(jié)合的檢測抗體。

  步驟6：添加底物

  洗滌后，將酶底物加入到每個孔中。底物與檢測抗體偶聯(lián)的酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生可測量的顏色變化。例如，TMB通常與HRP一起使用，反應(yīng)15-30分鐘后加入硫酸終止。

  步驟7：讀取結(jié)果

  使用微孔板讀數(shù)儀在適當(dāng)?shù)牟ㄩL（例如TMB為450nm）下測量每個孔的光密度。顏色變化的強度與樣品中抗原的濃度成正比，可以通過使用已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品將其與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來量化（圖3）。

  實驗注意事項

  1.小心處理樣本：避免反復(fù)凍融，因為這會降解敏感蛋白質(zhì)并影響檢測結(jié)果。與樣本收集和處理的方法保持一致。

  2.使用前將所有試劑放置至室溫：進(jìn)行ELISA時，務(wù)必將所有試劑放置至室溫，除非實驗方案明確規(guī)定不要這樣做。這將有助于確保結(jié)合動力學(xué)在測定之間保持一致，并將對溫度敏感的成分保持在溶液中。

  3.嫻熟移液技術(shù)：最佳實踐建議包括選擇適合要添加的體積的移液器、以一定角度握住移液器尖頭分配液體且不接觸孔底，并始終在不同的樣品或標(biāo)準(zhǔn)之間更換移液器尖頭以避免交叉污染。

  4.遵守方案：為了獲得可重復(fù)的結(jié)果，遵守方案至關(guān)重要，無論是試劑盒提供的方案還是內(nèi)部方法。這包括與樣品制備方式保持一致，始終使用優(yōu)化的檢測條件，并遵守孵育時間和溫度。一般來說，建議孵育時間每小時的差異不超過+/-5分鐘。

  5.結(jié)合對照和參考標(biāo)準(zhǔn)：對照用于數(shù)據(jù)分析和驗證檢測性能。建議將對照放置在能夠突顯任何板漂移的位置（例如，96孔板的第1列和第12列通常用作對照孔，陽性對照位于A1-D1和E12-H12孔中，陰性對照位于E1-H1和A12-D12孔中）。

  解決常見問題

  1：高背景信號

  可能的原因：由于阻斷不充分導(dǎo)致非特異性結(jié)合。

  解決方法：增加封堵劑濃度或延長封堵時間。

  2：信號低或無信號

  可能的原因：目標(biāo)蛋白或抗體的涂層不足。

  解決方案：確保適當(dāng)?shù)耐繉訚舛炔⒘舫鲎銐虻姆跤龝r間。

  3：結(jié)果不一致

  可能的原因：樣品處理或培養(yǎng)時間的變化。

  解決方案：標(biāo)準(zhǔn)化樣品處理程序，嚴(yán)格遵守所有步驟的時間安排。

  4：井間變異性高

  可能的原因：移液不均勻或孔填充不一致。

  解決方案：使用校準(zhǔn)的移液器，并確保在分配前徹底混合溶液。

  上述通蔚為大家介紹ELISA檢測方法，夾心ELISA法在科研領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛，了解夾心ELISA法及步驟，可以使用夾心ELISA獲得可靠、可重復(fù)的結(jié)果。