ELISA檢測(cè)試劑盒使用詳解

  ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒）(以下簡(jiǎn)稱ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒）)：是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。ELISA在實(shí)驗(yàn)過(guò)程可檢測(cè)血液、尿液或其他體液中的某些抗體、抗原和其他物質(zhì)。不過(guò)ELISA在實(shí)驗(yàn)過(guò)程要遵循一些使用注意事項(xiàng)。下文將圍繞ELISA檢測(cè)試劑盒使用為大家詳細(xì)介紹。

  ELISA檢測(cè)試劑盒組成

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)是一種用于檢測(cè)樣品中抗原或抗體的免疫學(xué)技術(shù)。ELISA還可用于定量樣品中的抗原、抗體、蛋白質(zhì)、酶或激素。它的組成有如下幾部分構(gòu)成：

  1.酶聯(lián)免疫試劑：包括酶結(jié)合物、抗體或抗原等，是ELISA試驗(yàn)中的關(guān)鍵試劑。酶結(jié)合物是指酶與抗體或抗原結(jié)合后的產(chǎn)物，具有催化反應(yīng)的作用；抗體或抗原則是用于特異性結(jié)合待測(cè)目標(biāo)分子的物質(zhì)。

  2.底物溶液：用于提供反應(yīng)所需底物，使酶催化反應(yīng)得以進(jìn)行。常見(jiàn)的底物溶液包括鄰苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺等。

  3.洗滌液：用于清洗反應(yīng)板上的非特異性結(jié)合物質(zhì)，提高試驗(yàn)的特異性。洗滌液一般由緩沖液和表面活性劑組成。

  4.終止液：用于終止酶促反應(yīng)，使顏色變化不再進(jìn)行。終止液一般含有酸或堿等能夠中和反應(yīng)液酸堿度的物質(zhì)。

  5.檢測(cè)板：用于承載反應(yīng)液，并提供反應(yīng)場(chǎng)所。檢測(cè)板一般由聚苯乙烯等材料制成，上面附有包被抗原或抗體的微孔。

  6.酶標(biāo)儀：用于檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，并定量測(cè)定待測(cè)目標(biāo)分子的濃度。酶標(biāo)儀具有高靈敏度、高精度和高重復(fù)性的特點(diǎn)。

  7.說(shuō)明書(shū)：詳細(xì)介紹了試劑盒的使用方法、注意事項(xiàng)和保存條件等信息，是用戶使用試劑盒的重要參考。

通蔚ELISA試劑盒

  試劑的保存與準(zhǔn)備

  試劑的準(zhǔn)備

  1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒：根據(jù)檢測(cè)目的選擇相應(yīng)的試劑盒，確保試劑盒的質(zhì)量和有效期。

  2.酶標(biāo)板：用于酶標(biāo)反應(yīng)的板條，一般選用聚苯乙烯材質(zhì)。

  3.酶標(biāo)抗體：與待測(cè)樣本中的抗原結(jié)合的抗體，通常使用間接法、競(jìng)爭(zhēng)法或夾心法等檢測(cè)方法。

  4.底物溶液：用于酶催化底物顯色的溶液。

  5.終止液：用于終止酶催化反應(yīng)的溶液。

  試劑的保存

  在ELISA檢測(cè)試劑盒使用前，除了了解試劑盒組成，還要對(duì)試劑做保存和準(zhǔn)備。這里我們簡(jiǎn)單羅列一下試劑保存注意事項(xiàng)。

  1、溫度條件：試劑保存條件應(yīng)遵循說(shuō)明書(shū)，我們建議溫度在2-8攝氏度的冰箱中，避免高溫和冷凍。對(duì)于某些特定的試劑，可能需要更嚴(yán)格的溫度控制，如-20℃或更低。具體要遵循您的實(shí)驗(yàn)要求和說(shuō)明書(shū)。避免反復(fù)凍融，盡量一次性使用完一瓶試劑。

   2、光照：某些試劑對(duì)光敏感，這里我們建議對(duì)光敏感試劑避光保存或者采用棕色瓶或鋁箔紙包裹試劑瓶。大家在購(gòu)買試劑盒之前，可以對(duì)試劑做些了解。

  3、防潮：試劑盒某些試劑對(duì)濕度較為敏感，因此，保證試劑干燥非常重要。在存儲(chǔ)試劑可以使用干燥劑和密封袋進(jìn)行防潮。

  避免污染

  試劑盒試劑可以貼上標(biāo)簽，便于分類。試劑避免與其他化學(xué)物質(zhì)存放，避免交叉污染。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程盡量用干凈的、專用的取樣器具。

  樣品準(zhǔn)備

  1.血清或血漿：通常使用血清或血漿作為待測(cè)樣本，需在采集后盡快分離并保存。

  2.組織勻漿：將組織研磨成勻漿，用于提取組織中的抗原。

  3.細(xì)胞培養(yǎng)上清液：用于檢測(cè)細(xì)胞分泌的抗原或抗體。

  儀器準(zhǔn)備

  1.酶標(biāo)儀：用于讀取酶標(biāo)板的吸光度值。

  2.洗板機(jī)：用于清洗酶標(biāo)板，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

  3.移液器：用于準(zhǔn)確移取溶液。

  4.離心機(jī)：用于血清或血漿的分離。

  上述一切準(zhǔn)備就緒，就開(kāi)始elisa檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)了

  實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

  1.實(shí)驗(yàn)前仔細(xì)閱讀試劑盒說(shuō)明書(shū)，了解實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟及注意事項(xiàng)。

  2.確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境清潔、干燥，避免外界干擾。

  3.實(shí)驗(yàn)前對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，確保儀器處于正常工作狀態(tài)。

  4.按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制所需的溶液，并按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。

  5.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，及時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

  6.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后及時(shí)清洗儀器和實(shí)驗(yàn)器具，并按照要求處理廢棄物。

  7.對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和解釋，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

  實(shí)驗(yàn)操作步驟

  ELISA檢測(cè)試劑盒有多種不同的檢測(cè)方法，今天我們就從直接法ELISA、間接法ELISA、夾心法ELISA、競(jìng)爭(zhēng)法ELISA四種方法給大家詳細(xì)講解。

  直接法ELISA詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟

  將抗原按一定的比例稀釋好包被到固相載體上，然后加入稀釋好的特異性的酶標(biāo)抗體，孵育后加入底物顯色并判讀結(jié)果。

  直接ELISA操作很簡(jiǎn)單，步驟也比較簡(jiǎn)練，但是其應(yīng)用范圍還是非常有限的，一個(gè)重要的原因是這種ELISA中只經(jīng)過(guò)了一步信號(hào)放大（酶的放大），所以其靈敏度不是很高；另外，其測(cè)定的對(duì)象也非常有限，只能測(cè)定酶標(biāo)記的分子。

  間接法ELISA詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟（具體操作可以參考說(shuō)明書(shū)哦）

  1、包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至最適濃度（5～20 ug/ml）各0.3 ml加于微反應(yīng)板每個(gè)凹孔中,4℃過(guò)夜或37℃水浴2～3小時(shí)，貯存冰箱。

  2、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

  3、加被檢標(biāo)本：每凹孔加入用含有0.05%吐溫-20的稀釋緩沖液稀釋的被檢血清各0.2 mL，37℃，作用1～2小時(shí)。

  4、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

  5、加入酶結(jié)合物：每凹孔加入稀釋緩沖液稀釋的酶結(jié)合物0.2 mL37℃作用1～2小時(shí)。

  6、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

  7、加入0.2 mL底物溶液于每個(gè)凹孔（OPD或OT），室溫作用30分鐘（另作一空白對(duì)照，0.4 mL底物加0.1 mL終止劑）。

  8、加終止劑：每凹孔加2 M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 mL。

  9、觀察記錄結(jié)果：目測(cè)或用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定（OPD用492 nm）OD值。

  夾心法ELISA詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟

  1、將具有專一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體。

  2、加入待測(cè)檢體，檢體中若含有待測(cè)的抗原，則其會(huì)與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)。

  3、洗去多余待測(cè)檢體，加入另一種對(duì)抗原專一的一次抗體，與待測(cè)抗原進(jìn)行鍵結(jié)。

  4、洗去多余未鍵結(jié)一次抗體，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結(jié)。

  5、洗去多余未鍵結(jié)二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果。

  四、競(jìng)爭(zhēng)法ELISA詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟

  1、包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度（1～10 ug/ml），每凹孔加0.3 ml，4℃過(guò)夜，或37℃水浴3小時(shí)，貯存冰箱。

  2、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

  3、分2組，a組加酶標(biāo)記抗原和被檢抗原混合液0.2 ml，b組只加酶標(biāo)記抗原液0.2 ml，37℃作用1～2小時(shí)。（混合液可作成不同稀釋度）

  4、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

  5、加入0.2 ml底物溶液于每個(gè)凹孔（OPD或OT），室溫作用30分鐘（另作一空白對(duì)照，0.4 ml底物加0.1 mL終止劑）。

  6、加終止劑：每凹孔加2 M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 mL。

  7、用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定a、b兩組OD值，并求出a、b、OD值的差數(shù)。

  上述操作步驟方法大家可以具體的結(jié)合自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行，也可以參考說(shuō)明書(shū)選擇一個(gè)合適的使用方法。

ELISA酶底物顯色

  結(jié)果分析與解讀

  在進(jìn)行ELISA數(shù)據(jù)分析時(shí)，首先需要對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)。這包括記錄每個(gè)樣本的吸光度值，通常使用微板閱讀器進(jìn)行測(cè)量。接下來(lái)，需要進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理，以確保不同實(shí)驗(yàn)之間的數(shù)據(jù)可比性。標(biāo)準(zhǔn)化的方法包括對(duì)照組的設(shè)定和數(shù)據(jù)的歸一化處理。

  一旦完成數(shù)據(jù)的整理和標(biāo)準(zhǔn)化處理，就可以進(jìn)行ELISA數(shù)據(jù)的結(jié)果解讀。通常情況下，ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果以吸光度值或濃度值的形式呈現(xiàn)。研究人員需要將這些數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和假設(shè)進(jìn)行比較，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。同時(shí)，還需要對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著性和可靠性。

  在ELISA數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀中，還需要考慮實(shí)驗(yàn)的潛在誤差和偏差。例如，操作技術(shù)的差異、實(shí)驗(yàn)條件的變化等因素都可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，研究人員需要對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能存在的誤差進(jìn)行全面的考慮，并在數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀中進(jìn)行相應(yīng)的修正。

  ELISA檢測(cè)試劑盒使用介紹到這里，在使用ELISA試劑盒過(guò)程，要做好詳細(xì)實(shí)驗(yàn)記錄，把實(shí)驗(yàn)遇到問(wèn)題記錄下來(lái)，避免下次實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)同樣問(wèn)題束手無(wú)策?？偟膩?lái)說(shuō)，未來(lái)幾年，ELISA試劑盒在檢測(cè)各種疾病和病癥方面預(yù)計(jì)將變得更加先進(jìn)、準(zhǔn)確和高效。文章內(nèi)容來(lái)自實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和其它論文參考，有不對(duì)地方多多指教。

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