酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)因其高靈敏度而受到青睞，能夠檢測出非常低濃度的物質(zhì)（低至每毫升0.0001-0.01毫克）。它廣泛用于查找和測量肽、蛋白質(zhì)、抗體、激素、藥物和潛在的食物過敏原，如牛奶、花生和雞蛋，這些對于轉(zhuǎn)基因食品檢測很重要。它的工作原理是利用抗原和抗體之間的特定相互作用，以及產(chǎn)生可檢測信號的酶。ELISA于20世紀(jì)70年代開發(fā)，利用抗體的精確度和酶的活性來分析生物樣本，從而提供一種靈敏而具體的方法。隨著時間的推移，ELISA不斷改進以提高其靈敏度，現(xiàn)在有不同類型的ELISA來檢測各種生物標(biāo)志物。
Elisa實驗方案：
一、涂層：
涂層將抗原或捕獲抗體固定在微量滴定板上。
這是通過將培養(yǎng)皿與含有抗原或抗體的溶液一起孵育來完成的。
抗原或抗體的選擇取決于具體的應(yīng)用和靶分子。
適當(dāng)?shù)臐舛群头跤龝r間對于成功的檢測結(jié)果至關(guān)重要。
二、阻塞：
阻斷可防止微量滴定板上的非特異性結(jié)合。
降低背景噪音并提高檢測特異性。
用一抗或抗原包被后，向孔中添加封閉蛋白（例如，BSA、酪蛋白或牛奶）。
阻斷蛋白質(zhì)與未占據(jù)的位點結(jié)合，減少非特異性結(jié)合。
孵育培養(yǎng)板以允許阻斷蛋白結(jié)合，然后用緩沖液洗去多余的蛋白。
阻斷后，可將一抗或抗原添加到孔中。
三、樣品和標(biāo)準(zhǔn)添加：
標(biāo)準(zhǔn)通常是一組已知濃度的抗原，用于生成校準(zhǔn)曲線。
將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品添加到板的單獨孔中，而將未知樣品添加到重復(fù)的或重復(fù)的三孔中。
四、一抗孵育：
此步驟涉及添加特定的一抗以結(jié)合微量滴定板上的抗原。
一抗通常來自特定物種（例如小鼠或兔）并且可以被標(biāo)記或未標(biāo)記。
如果一抗未標(biāo)記，則稍后添加與酶（例如HRP或AP）偶聯(lián)的二抗以產(chǎn)生可測量的信號。
五、二抗孵育：
一抗-抗原復(fù)合物將二抗連接至微量滴定板。
這種連接使得酶能夠與底物結(jié)合并產(chǎn)生可測量的信號。
來自酶偶聯(lián)二抗的信號與樣品中一抗或抗原的量成比例。
六、底物添加：
底物與二抗偶聯(lián)的酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測的信號，該信號可使用微孔板讀數(shù)儀進行量化。
顯色底物會產(chǎn)生可在特定波長下讀取的有色反應(yīng)產(chǎn)物，而化學(xué)發(fā)光底物則會發(fā)出光，可通過光度計進行測量。
應(yīng)優(yōu)化反應(yīng)時間和底物濃度以產(chǎn)生足夠的信號而不引起背景噪音。
七、停止解決方案：
常用的終止溶液是硫酸，在底物孵育步驟后將其添加到孔中。
添加終止溶液對于確保反應(yīng)不再繼續(xù)以及產(chǎn)生的信號穩(wěn)定且可重復(fù)至關(guān)重要。
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