ELISA實驗原理及步驟：從入門到精通

  ELISA是酶聯(lián)免疫吸附分析的縮寫。在這種實驗方法中，使用免疫吸附劑（與固體表面結(jié)合的抗原或抗體）和酶聯(lián)免疫反應(yīng)物。例如，ELISA用于利用未標(biāo)記的未知物和標(biāo)記的反應(yīng)物之間的競爭性結(jié)合來檢測未知濃度。ELISA不但成為了一種非常簡便的研究工具，而且迅速地應(yīng)用于各種生物活性物質(zhì)及標(biāo)志物的臨床檢測，并在臨床應(yīng)用中逐步取代了放免技術(shù)。下面上海通蔚為大家全面了解ELISA實驗原理、步驟和注意事項.

  ELISA試劑盒原理

  ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定） 是一種將抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機結(jié)合而發(fā)展起來的一種綜合性技術(shù)。其基本原理是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性，將待測物質(zhì)與酶標(biāo)記的抗體或抗原結(jié)合，通過酶催化底物顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色深淺進行定性或定量分析。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合方式，有直接法、間接法、夾心法、競爭法等。下面詳細(xì)介紹：

  直接ELISA

  在直接ELISA中，待測抗原被吸附到反應(yīng)板的孔中，并進行洗滌去除未結(jié)合的抗原。隨后，添加酶標(biāo)記的抗體，該抗體能夠特異性識別抗原?？贵w與抗原結(jié)合后，加入底物溶液，酶催化底物發(fā)生顏色變化，顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。


  優(yōu)缺點分析:

  1.優(yōu)點:

• 操作簡單快速：直接ELISA僅使用一種抗體，步驟較少，減少了誤差的可能性，提高了實驗效率。

• 避免交叉反應(yīng)：直接ELISA不使用第二抗體，因此可以避免第二抗體與其他抗體的交叉反應(yīng)，提高檢測的特異性。

  2.缺點:

• 抗體標(biāo)記難度：為每種抗原準(zhǔn)備相應(yīng)的標(biāo)記抗體，需要額外的時間和成本。

• 靈敏度較低：由于標(biāo)記抗體的密度較低，直接ELISA的靈敏度可能低于間接ELISA。

  在直接ELISA法中，為了提高直接ELISA法的靈敏度，可以嘗試以下幾種方法：

  1.使用高親和力的標(biāo)記抗體：

  選擇與抗原結(jié)合能力更強的標(biāo)記抗體，可以提高抗原的識別效率，從而提高靈敏度。

  可以使用單克隆抗體，因為單克隆抗體具有更高的特異性和親和力。

  2.優(yōu)化標(biāo)記方法：

  可以嘗試不同的標(biāo)記方法，例如使用更有效的酶或熒光標(biāo)記物，以提高標(biāo)記效率和靈敏度。

  可以嘗試對抗體進行優(yōu)化，例如改變抗體的結(jié)構(gòu)或進行修飾，以提高其標(biāo)記效率。

  3.提高抗原的包被密度：

  在進行ELISA實驗時，可以通過增加抗原的包被濃度或延長包被時間，提高抗原在反應(yīng)板上的吸附密度，從而提高檢測靈敏度。

  4.使用信號放大技術(shù)：

  可以使用一些信號放大技術(shù)，例如生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，來放大信號，提高檢測靈敏度。

  5.使用更靈敏的檢測方法：

  可以使用更靈敏的檢測方法，例如化學(xué)發(fā)光檢測法，來提高檢測的靈敏度。

  6.優(yōu)化實驗條件：

  優(yōu)化實驗條件，例如調(diào)整孵育時間、洗滌步驟、底物濃度等，可以提高實驗的效率和靈敏度。

  7.使用更敏感的試劑盒：

  選擇專門為提高靈敏度設(shè)計的直接ELISA試劑盒，例如使用高靈敏度的酶標(biāo)記抗體或高靈敏度的底物。

  間接ELISA

  間接ELISA使用兩種抗體：第一抗體（一抗）特異性識別待測抗原，第二抗體（二抗）特異性識別一抗。首先，待測抗原被吸附到反應(yīng)板的孔中，并進行洗滌去除未結(jié)合的抗原。然后，加入一抗，一抗與抗原結(jié)合。接著，加入酶標(biāo)記的二抗，二抗與一抗結(jié)合。最后，加入底物溶液，酶催化底物發(fā)生顏色變化，顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。


  優(yōu)缺點分析:

  1.優(yōu)點:

• 降低成本：可以利用同一物種的多種一抗，并使用相同的標(biāo)記二抗進行檢測，降低實驗成本和工作量。

• 提高靈敏度：由于一抗未被標(biāo)記，可以保持其天然的免疫活性，提高檢測的靈敏度。此外，高密度的二抗標(biāo)記能夠放大信號，進一步提高檢測靈敏度。

  2.缺點:

• 存在交叉反應(yīng)：二抗可能與其他抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致非特異性信號，降低檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

• 延長實驗時間：間接ELISA需要額外的孵育步驟，增加了實驗時間。

  在間接ELISA法中，為了避免存在交叉反應(yīng)，要注意：

  1、選擇高純度的二抗：高純度的二抗可以降低雜質(zhì)抗體存在的可能性。

  2、選擇對一抗具有高度特異性的二抗：這樣可以確保二抗只與一抗結(jié)合，而不會與其他抗體結(jié)合。

  3、進行對照實驗：在進行ELISA實驗時，需要設(shè)置對照組，排除二抗的交叉反應(yīng)造成的假陽性結(jié)果。

  夾心ELISA

  夾心ELISA需要使用兩對抗體，分別識別抗原的不同表位，而且這兩個表位不能重疊。首先，將捕獲抗體固定在反應(yīng)板的孔中。然后，加入待測樣本，如果樣本中含有待測抗原，抗原就會與捕獲抗體結(jié)合。接著，加入酶標(biāo)記的檢測抗體，它能夠識別與捕獲抗體結(jié)合的抗原。最后，加入底物溶液，酶催化底物發(fā)生顏色變化，顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。


  優(yōu)缺點分析:

  1.優(yōu)點:

• 高特異性：由于使用兩種針對同一抗原不同表位的抗體，夾心ELISA具有很高的特異性，可以有效地識別并檢測目標(biāo)抗原。
• 適用范圍廣：夾心ELISA適用于復(fù)雜或粗/不純的樣品，無需對抗原進行預(yù)處理，可以直接進行檢測。
• 靈敏度高：夾心ELISA的靈敏度較高，可以檢測微量的抗原。

  2.缺點:

• 需要定制開發(fā)抗體：如果市面上沒有現(xiàn)成的配對抗體，就需要定制開發(fā)，這會增加時間和成本。

  競爭ELISA

  競爭性ELISA是一種用于測量樣本中抗原或抗體濃度的免疫學(xué)檢測方法，特別適用于檢測小分子抗原或抗體。它的原理是：將待測樣本中的抗原或抗體與已知濃度的標(biāo)記抗原或抗體（參考物質(zhì)）進行競爭性結(jié)合，競爭結(jié)合到固相載體上的抗體或抗原。樣本中的抗原或抗體濃度越高，與標(biāo)記參考物質(zhì)競爭結(jié)合的量就越少，最終產(chǎn)生的信號強度就越弱。

  優(yōu)缺點分析:

  競爭性ELISA可以基于直接ELISA、間接ELISA或夾心ELISA的檢測方法，因此其優(yōu)缺點也與所選用的檢測方法有關(guān)。

  1.優(yōu)點:

• 高靈敏度：可以檢測微量的抗原或抗體。
• 適用于小分子抗原或抗體：可以檢測無法直接捕獲或檢測的小分子抗原或抗體。

  2.缺點:

• 操作復(fù)雜：需要額外的步驟來進行競爭性結(jié)合反應(yīng)。
• 需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制：需要確保參考物質(zhì)的濃度和質(zhì)量穩(wěn)定。

  ELISA優(yōu)缺點

  酶聯(lián)免疫吸附試驗由EvaEngvall和PeterPerlmann于1971年首次描述，是一種廣泛使用的分析生物化學(xué)實驗。與其他免疫測定程序相比，ELISA具有許多優(yōu)點：

  1、由于其出色的敏感性和特異性而被經(jīng)常使用。

  2、與放射免疫分析(RIA)測試等其他程序相比，ELISA的準(zhǔn)確性更高。

  3、最常見的ELISA檢測形式是96孔微孔板。大多數(shù)ELISA微孔板都有分開的孔，必要時可以進行小規(guī)模的檢測。主要優(yōu)點是一次檢測可以進行96次測定，結(jié)果通常在3小時內(nèi)即可得出。這是一種省時且經(jīng)濟的方法。

  4、ELISA不需要使用放射性同位素或昂貴的輻射計數(shù)器。只需要精確的微量移液器、培養(yǎng)箱、清洗系統(tǒng)和微孔板分光光度計讀數(shù)器。

  ELISA缺點：

  ELISA中對免疫原性抗原的抑制不足會導(dǎo)致錯誤結(jié)果。

  由于抗體是蛋白質(zhì)，因此必須冷藏運輸和儲存。

  ELISA制備抗體需要大量時間且成本高昂。

  其中出現(xiàn)假陽性和假陰性的概率很高。

  ELISA抗體存在不穩(wěn)定性。

  ELISA實驗步驟

  一、實驗準(zhǔn)備：

  1.試劑準(zhǔn)備：

  IL-1βELISA試劑盒（包含：包被抗體、檢測抗體、酶結(jié)合物、標(biāo)準(zhǔn)品、底物溶液、終止液、洗滌液等）

  PBS緩沖液(pH7.4)

  蒸餾水

  微量移液器

  吸頭

  酶標(biāo)板

  酶標(biāo)儀

  孵育箱

  洗板機(可選)

  離心機(可選)

  2.樣本準(zhǔn)備：

  采集需要檢測IL-1β的樣本，例如血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。

  按照試劑盒說明書的要求處理樣本，例如離心去除細(xì)胞碎片、稀釋等。

  準(zhǔn)備好空白對照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本。

  3.實驗器材準(zhǔn)備：

  準(zhǔn)備合適的酶標(biāo)板，通常為96孔板。

  準(zhǔn)備移液器、吸頭、孵育箱、洗板機、酶標(biāo)儀等實驗器材。

  二、實驗步驟：

  1.包被：

  將試劑盒中的包被抗體(捕捉抗體)稀釋至合適的濃度，并按照說明書的要求加入到酶標(biāo)板孔中。

  將酶標(biāo)板置于4℃冰箱過夜或37℃孵育2小時，使抗體牢固地吸附在酶標(biāo)板上。

  用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次，去除未結(jié)合的抗體。

  2.封閉：

  將試劑盒中的封閉液加入到酶標(biāo)板孔中，并按照說明書的要求進行孵育(通常為37℃1小時)。

  封閉液可以阻止酶標(biāo)板表面非特異性結(jié)合，減少實驗誤差。

  用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次，去除未結(jié)合的封閉液。

  3.加樣：

  加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對照(空白對照通常只加入緩沖液，不加樣本)到酶標(biāo)板孔中，每個孔的體積通常為100μL。

  按照說明書的要求進行孵育(通常為37℃1小時)。

  4.洗滌：

  用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次，去除未結(jié)合的物質(zhì)。

  5.加入酶結(jié)合物：

  將試劑盒中的酶結(jié)合物(通常為酶標(biāo)記的檢測抗體)稀釋至合適的濃度，并加入到酶標(biāo)板孔中。

  按照說明書的要求進行孵育(通常為37℃1小時)。

  6.洗滌：

  用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物。

  7.加入底物溶液：

  將試劑盒中的底物溶液加入到酶標(biāo)板孔中，并按照說明書的要求進行反應(yīng)(通常為室溫避光孵育15-30分鐘)。

  酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化。

  8.終止反應(yīng)：

  加入終止液(通常為酸性溶液)，終止顯色反應(yīng)，防止顏色繼續(xù)加深。

  9.比色：

  用酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度值，并按照試劑盒提供的說明書進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，最終計算出樣本中IL-1β的濃度。

  10.’注意事項：

  嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作，不同的試劑盒可能會有不同的操作步驟和參數(shù)。

  確保所有試劑和器材處于最佳狀態(tài)，例如試劑的有效期、酶標(biāo)儀的校準(zhǔn)等。

  注意實驗環(huán)境，例如溫度、濕度、光照等因素會影響實驗結(jié)果。

  做好實驗記錄，包括實驗日期、試劑批號、樣本信息、操作步驟、結(jié)果等，便于日后分析和追溯。

  注意實驗室安全，例如戴手套、穿實驗服、操作規(guī)范等。

  上述為大家介紹ELISA實驗原理及步驟，通過原理和步驟對ELISA有初步的認(rèn)識。除此之外，在實驗中多加實踐，有助于提高實驗效果。上海通蔚實業(yè)有限公司擁有15年以上的ELISA試劑盒生產(chǎn)經(jīng)驗，搭建了ELISA試劑盒開發(fā)和成熟抗原-抗體系統(tǒng)的良好平臺?？商峁?000多種ELISA試劑盒，主要采用夾心法和競爭法，覆蓋3000個靶標(biāo)，涉及小鼠、大鼠、牛、兔、豬等20多個種類。如需試劑盒，歡迎前來咨詢！