一文詳解蛋白質(zhì)純化方法和技術(shù)

  在進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)蛋白質(zhì)往往離不開(kāi)純化，蛋白質(zhì)純化是從復(fù)雜的生物材料混合物（例如細(xì)胞提取物或培養(yǎng)上清液）中分離出特定的目標(biāo)蛋白質(zhì)。目標(biāo)是獲得高純度的所需蛋白質(zhì)，同時(shí)有效去除污染物等，使得使得ELISA檢測(cè)結(jié)果更具特異性和靈敏性。接下來(lái)上海通蔚帶大家了解下蛋白質(zhì)純化。

  蛋白質(zhì)純化目的

  了解蛋白質(zhì)純化的目的對(duì)于有效的資源分配、質(zhì)量控制和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)至關(guān)重要。它確保純化過(guò)程能夠滿足特定目標(biāo)，無(wú)論是獲取高純度蛋白質(zhì)、最大化產(chǎn)量、保持蛋白質(zhì)活性，還是滿足下游實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)。

  這種清晰度提高了蛋白質(zhì)純化的整體效率和成功率，有助于更有效的研究和生物技術(shù)進(jìn)步。蛋白質(zhì)純化的主要目標(biāo)如下：

  1.獲得樣品的高純度：主要目標(biāo)是分離高純度的目標(biāo)蛋白質(zhì)，去除其他分子和污染物。

  2.與污染物分離：蛋白質(zhì)通常與其他生物分子（如核酸、脂質(zhì)和其他蛋白質(zhì)）一起存在于復(fù)雜的混合物中。純化的目的是將目標(biāo)蛋白質(zhì)與這些污染物分離。

  3.保持蛋白質(zhì)的完整性：純化過(guò)程不應(yīng)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性或生物功能。蛋白質(zhì)應(yīng)盡可能保持其天然狀態(tài)。

  4.定量和濃縮：確定純化蛋白的濃度對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。可能需要將蛋白濃縮到更高濃度。

  5.可靠且可重復(fù)的結(jié)果：凈化過(guò)程應(yīng)可靠且可重復(fù)，以便在研究或生產(chǎn)中獲得一致的結(jié)果。

  蛋白質(zhì)純化工作流程的主要步驟是什么

  典型的蛋白質(zhì)純化工作流程始于識(shí)別蛋白質(zhì)來(lái)源。這通常是蛋白質(zhì)天然存在的細(xì)胞或組織類型?；蛘?，感興趣的靶標(biāo)可以在宿主細(xì)胞系中重組產(chǎn)生。在這種情況下，蛋白質(zhì)通常被設(shè)計(jì)為在N端或C端表達(dá)融合標(biāo)簽，以方便分離和檢測(cè)。

  接下來(lái)，必須破碎細(xì)胞以釋放蛋白質(zhì)含量。機(jī)械方法包括均質(zhì)化和超聲處理，而非機(jī)械方法則包括使用洗滌劑和有機(jī)溶劑。方法的選擇取決于樣品類型和目標(biāo)，但應(yīng)始終使用適當(dāng)?shù)木彌_液、蛋白酶抑制劑和其他藥劑來(lái)防止蛋白質(zhì)降解并保持溶解度。

  一旦蛋白質(zhì)溶解，就可以進(jìn)行純化，如下所述。之后，使用包括SDS-PAGE、質(zhì)譜、X射線晶體學(xué)和各種功能測(cè)定在內(nèi)的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)表征和分析。

  1.蛋白質(zhì)純化方法

  蛋白質(zhì)純化方法利用溶解度、大小、電荷和分子識(shí)別等特性來(lái)分離目標(biāo)靶標(biāo)。以下是一些主要方法：

  2.沉淀

  沉淀法使用鹽、有機(jī)溶劑或pH值變化來(lái)改變蛋白質(zhì)溶解度并引起聚集。雖然這些技術(shù)可能會(huì)導(dǎo)致不需要的蛋白質(zhì)共沉淀，但它們可作為初始純化步驟，尤其是在處理大量蛋白質(zhì)時(shí)。

  3.離心

  離心法根據(jù)密度分離蛋白質(zhì)。雖然基本離心法廣泛用于從粗樣品中去除細(xì)胞碎片，但差速離心和密度梯度離心等技術(shù)可進(jìn)行粗分離，通常作為多步純化方案的一部分。

  4.透析和超濾

  透析和超濾根據(jù)蛋白質(zhì)通過(guò)選擇性滲透膜的能力，按分子量分離蛋白質(zhì)。透析涉及被動(dòng)擴(kuò)散，而超濾利用壓力（通常是離心力）來(lái)驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)。這些方法常用于脫鹽、緩沖液交換和濃縮蛋白質(zhì)溶液。

  5.色譜法

  色譜法通過(guò)蛋白質(zhì)與固體支持物（固定相）的相互作用來(lái)分離溶液中的蛋白質(zhì)混合物（流動(dòng)相）。色譜法包括以下幾種，其中許多已適用于快速蛋白質(zhì)液相色譜法(FPLC)，這是一種使用泵控制流速的方法：

  1)尺寸排阻色譜法(SEC)可按蛋白質(zhì)大小分離通過(guò)充滿多孔珠的色譜柱的蛋白質(zhì)。較大的蛋白質(zhì)會(huì)先繞過(guò)孔隙，從而先洗脫，而較小的蛋白質(zhì)則需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能穿過(guò)色譜柱。

  2)離子交換色譜法(IEX)使用帶電樹(shù)脂，根據(jù)蛋白質(zhì)在特定pH下的凈電荷來(lái)分離蛋白質(zhì)。通過(guò)增加鹽濃度或改變緩沖液的pH值來(lái)進(jìn)行洗脫。

  3)疏水相互作用色譜法(HIC)使用高鹽結(jié)合緩沖液和疏水性樹(shù)脂，根據(jù)疏水性分離蛋白質(zhì)。降低鹽濃度會(huì)導(dǎo)致疏水性最差的蛋白質(zhì)首先離開(kāi)色譜柱，然后是疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)。

  4)親和層析利用蛋白質(zhì)與其配體之間的特定相互作用，例如抗體與抗原（例如蛋白質(zhì)標(biāo)簽）結(jié)合。與通常構(gòu)成多步純化方案一部分的SEC、IEX和HIC不同，親和純化通常可以消除對(duì)其他純化策略的需求。

  上述是上海通蔚為大家介紹蛋白質(zhì)純化及常見(jiàn)的方法，蛋白質(zhì)純化為ELISA實(shí)驗(yàn)提供了更純凈、活性更高的樣品，這不僅提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，也能降低實(shí)驗(yàn)中的誤差和試劑消耗，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。