抗體檢測(cè)知多少？這些方法你都知道嗎？

抗體是各種實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的強(qiáng)大研究工具。在這里，上海通蔚給大家介紹一些檢測(cè)抗體的常用方法，這些方法包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn) (ELISPOT)、蛋白質(zhì)印跡 (WB)、免疫沉淀 (IP) 和染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP)、免疫組織化學(xué) (IHC)、免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）、流式細(xì)胞儀和 FACS。

內(nèi)容

1. 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)

2. 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn) (ELISPOT)

3. 蛋白質(zhì)印跡 (WB)

4. 免疫沉淀 (IP) 和染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP)

5. 免疫組織化學(xué) (IHC)

6. 免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）

7. 流式細(xì)胞儀和FACS

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)

  ELISA 是一種基于板的技術(shù)，能夠檢測(cè)生物樣品中的抗原。與其他免疫測(cè)定一樣，ELISA 依靠抗體利用高度特異性的抗體-抗原相互作用來(lái)檢測(cè)目標(biāo)抗原。ELISA 能夠?qū)Ψ治鑫锖头肿酉嗷プ饔眠M(jìn)行定量和表征。

  在 ELISA 中，抗原直接固定在固體表面上，或者更常見(jiàn)的是通過(guò)捕獲抗體固定在固體表面上，捕獲抗體本身也固定在表面上（圖 1）。清洗表面，然后與與酶或熒光團(tuán)等分子綴合的檢測(cè)抗體一起孵育。

  在抗原存在的情況下，這些檢測(cè)抗體將保持與板結(jié)合，從而提供信號(hào)。該信號(hào)的強(qiáng)度對(duì)應(yīng)于樣品內(nèi)的抗原濃度。

  圖 1.夾心 ELISA 設(shè)置。多孔板上的捕獲抗體將固定感興趣的抗原。該抗原將被與生物素和鏈霉親和素-HRP 綴合的檢測(cè)抗體識(shí)別并結(jié)合。

  ELISA 通常在多孔板（96 或 384 孔）中進(jìn)行，分析物的固定有助于將抗原與其余樣品成分分離。這些特性使 ELISA 成為同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行的最簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法之一。

  ELISA 有四種主要類(lèi)型：直接法、間接法、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法，每種類(lèi)型都有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)和適用性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)最合適的 ELISA 形式取決于許多因素，包括所需的靈敏度、特異性和測(cè)定時(shí)間。詳細(xì)了解，請(qǐng)點(diǎn)擊elisa的類(lèi)型。

  酶聯(lián)免疫斑點(diǎn) (ELISPOT)

  酶聯(lián)免疫斑點(diǎn) (ELISPOT) 用于檢測(cè)細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。該技術(shù)能夠量化和比較對(duì)各種刺激的免疫反應(yīng)。

  細(xì)胞在帶有抗體包被的 PVDF 或硝酸纖維素膜的 96 孔板中生長(zhǎng)。使用一抗和綴合二抗檢測(cè)感興趣的分泌蛋白。分泌感興趣蛋白質(zhì)的細(xì)胞將顯示為彩色或熒光點(diǎn)。對(duì)膜進(jìn)行掃描和分析，以量化分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞的數(shù)量或比例。

  蛋白質(zhì)印跡 (WB)

  蛋白質(zhì)印跡廣泛用于分離和鑒定蛋白質(zhì)的研究中。蛋白質(zhì)印跡使我們能夠檢測(cè)蛋白質(zhì)，確定樣品之間的相對(duì)蛋白質(zhì)水平，并確定目標(biāo)的分子量，從而深入了解其翻譯后處理。

  蛋白質(zhì)印跡涉及三個(gè)主要步驟：(1) 按大小分離蛋白質(zhì)，(2) 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，以及 (3) 使用一抗和二抗可視化目標(biāo)蛋白。

  第一步，將蛋白質(zhì)加載到凝膠上，并通過(guò)凝膠電泳根據(jù)大小進(jìn)行分離。然后利用電流將蛋白質(zhì)條帶遷移到膜上。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上是必不可少的，因?yàn)橛糜陔娪镜哪z為隨后的免疫染色提供了較差的表面，即抗體不會(huì)粘附到凝膠的蛋白質(zhì)上。

  最后，膜可以用感興趣目標(biāo)的特異性抗體進(jìn)一步進(jìn)行免疫染色，并使用二抗和檢測(cè)試劑進(jìn)行可視化。

  免疫沉淀 (IP) 和染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP)

  免疫沉淀 (IP) 是一種分離和純化單個(gè)蛋白質(zhì)和復(fù)合蛋白質(zhì)的多功能技術(shù)。在該技術(shù)中，抗體被固定在固相基質(zhì)（例如磁珠/瓊脂糖珠）上，從復(fù)雜溶液中捕獲抗原。

  染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 用于確定給定蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)與特定 DNA 序列結(jié)合。ChIP 使研究人員能夠識(shí)別整個(gè)基因組中感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合的特定基因和序列，從而為其調(diào)控功能和機(jī)制提供關(guān)鍵線(xiàn)索。

  ChIP 程序（圖 3）利用抗體對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)（例如轉(zhuǎn)錄因子）及其相關(guān) DNA 進(jìn)行免疫沉淀。然后回收相關(guān)的 DNA，并通過(guò) PCR、微陣列或測(cè)序進(jìn)行分析，以確定基因組序列和蛋白質(zhì)結(jié)合的位置。

  免疫組織化學(xué) (IHC)

  免疫組織化學(xué) (IHC) 是一種利用抗體-抗原相互作用來(lái)了解組織切片中抗原的分布和定位的方法。盡管 IHC 的定量程度低于蛋白質(zhì)印跡或 ELISA，但它具有在完整組織中表征蛋白質(zhì)表達(dá)的優(yōu)勢(shì)。

  IHC 通常用于診斷癌癥等疾病中的組織異常。IHC 提供了寶貴的觀(guān)點(diǎn)和支持，可以將從其他方法獲得的數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)。

  IHC 染色依賴(lài)于識(shí)別目標(biāo)抗原的抗體。您可以使用顯色或基于熒光的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)可視化這種抗體-抗原相互作用。在顯色檢測(cè)中，抗體與酶結(jié)合，當(dāng)暴露于顯色劑時(shí)會(huì)產(chǎn)生有色沉淀。在熒光檢測(cè)中，抗體與熒光團(tuán)綴合。樣品制備和可視化有多種技術(shù)，所使用的方法應(yīng)根據(jù)您的標(biāo)本類(lèi)型和所需的靈敏度程度進(jìn)行定制。

  免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）

  免疫細(xì)胞化學(xué) (ICC) 用于使用標(biāo)記抗體研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞分布。與 IHC 不同，該技術(shù)側(cè)重于細(xì)胞樣本而不是組織塊。

  在 ICC 染色中，針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體應(yīng)用于已固定和透化的細(xì)胞培養(yǎng)樣品。ICC 有兩種類(lèi)型：直接和間接。直接 ICC 使用偶聯(lián)的一抗，而間接 ICC 涉及未偶聯(lián)的一抗，然后通過(guò)偶聯(lián)的二抗進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于大多數(shù) ICC 實(shí)驗(yàn)，抗體都用熒光團(tuán)標(biāo)記，這對(duì)于共定位研究來(lái)說(shuō)是理想的選擇。各種成像技術(shù)，例如寬場(chǎng)、共焦或旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)顯微鏡，可用于檢測(cè)信號(hào)。

  流式細(xì)胞儀和 FACS

  流式細(xì)胞術(shù)是一種流行的基于激光的技術(shù)，用于分析細(xì)胞或顆粒的特征。該技術(shù)測(cè)量與混合群體中單個(gè)細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記抗體發(fā)出的熒光。此外，不同細(xì)胞對(duì)光的散射可用于確定它們的大小和特性。

  流式細(xì)胞術(shù)使您能夠分析細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子的表達(dá)，表征和定義異質(zhì)細(xì)胞群中的不同細(xì)胞類(lèi)型，評(píng)估分離亞群的純度，并分析細(xì)胞大小和體積。它允許同時(shí)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析。

  熒光激活細(xì)胞分選 (FACS) 是流式細(xì)胞術(shù)的衍生技術(shù)，可根據(jù)熒光標(biāo)記將細(xì)胞群物理分離成亞群。