PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)輕松上手：圖解詳解步驟，助您快速掌握

  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 有時(shí)稱(chēng)為分子復(fù)印，傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 有時(shí)稱(chēng)為分子復(fù)印，是一種用于放大（復(fù)制）樣品中痕量 DNA 和 RNA 的技術(shù)。PCR 熱循環(huán)儀用于生產(chǎn)研究所需的大量樣品。

  PCR 過(guò)程可用于多種實(shí)驗(yàn)室和臨床應(yīng)用和目的。法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室用它來(lái)分析犯罪現(xiàn)場(chǎng)的 DNA 樣本。臨床醫(yī)療保健實(shí)驗(yàn)室用它來(lái)診斷病毒感染的患者。制藥研究實(shí)驗(yàn)室使用它來(lái)分析和復(fù)制 DNA 和 RNA 樣本，用于藥物和疫苗的制造。

  PCR原理

  在PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程，需要四種成分（試劑或化學(xué)品）如下：

  DNA 或 RNA 樣本（來(lái)自唾液、血液、頭發(fā)、皮膚刮屑等）

  （1）、DNA 引物：促進(jìn)核苷酸互補(bǔ)鏈合成的短單鏈 DNA

   （2）、DNA聚合酶：一種有助于合成DNA互補(bǔ)鏈的酶

  （3）、含有腺嘌呤 (A)、胸苷 (T)、胞嘧啶 (C) 和鳥(niǎo)嘌呤 (G) 的核苷酸溶液混合物，用于構(gòu)建重復(fù)的 DNA 鏈

  原理分為四步走，如下：

  （1）變性：是利用DNA在體外高溫時(shí)變性，雙鏈解離變成單鏈；

  （2）退火：低溫時(shí)引物與單鏈DNA按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合；

  （3）延伸：再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72℃左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5’- 3’)的方向合成互補(bǔ)鏈。

  將這3個(gè)步驟重復(fù)（“循環(huán)”）25-35次，即可按指數(shù)方式獲得精確的目標(biāo)DNA拷貝。

  PCR原理是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物原料，在引物引導(dǎo)的情況下，模板與底物通過(guò)DNA聚合酶的聚合延伸，多次重復(fù)后使DNA呈指數(shù)擴(kuò)增復(fù)制。

  PCR流程步驟

  PCR過(guò)程有 4 個(gè)步驟：收集、制備、擴(kuò)增和 PCR 后清理。PCR 機(jī)器步驟發(fā)生在擴(kuò)增步驟中。首先將一段 DNA 樣本與上面列出的試劑和化學(xué)品一起放入合適的試管中。將管放入PCR 機(jī)或熱循環(huán)儀中。熱循環(huán)儀通過(guò) 3 個(gè)步驟處理溶液：變性、退火和延伸。

  PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)步驟

  第 1 步 - 變性

  使用熱循環(huán)儀將管中包含的溶液加熱至至少 94°C (201.2°F)。熱量會(huì)破壞原始 DNA 樣品的氫鍵，并將 DNA 分離成單鏈（這稱(chēng)為雙鏈 DNA 變性）。

  第 2 步 - 退火

  然后將樣品混合物冷卻至 50 至 60°C（122 至 140°F），使 DNA 引物和 DNA 聚合酶與通過(guò)加熱分離的各個(gè) DNA 鏈結(jié)合（這稱(chēng)為 DNA 退火）引物）。此時(shí)，添加的混合物溶液中的核苷酸（A、T、C、G）將與加熱過(guò)程中產(chǎn)生的單獨(dú)的 DNA 鏈配對(duì)。

  第 3 步 - 擴(kuò)展

  一旦連接在一起，它們就會(huì)形成一條新的互補(bǔ) DNA 鏈（稱(chēng)為 DNA 延伸）。因此，由原始樣品分子的每條單鏈形成了新的雙鏈DNA分子副本。溫度從 95°C 循環(huán)至 50 至 60°C。然后使用熱循環(huán)器重復(fù)該循環(huán)約 35 至 40 次，熱循環(huán)器自動(dòng)重復(fù)該過(guò)程的加熱和冷卻循環(huán)。每次循環(huán)儀進(jìn)行加熱/冷卻循環(huán)時(shí)，所得 DNA 序列都會(huì)加倍。因此，最初來(lái)自一個(gè)樣本的一小段 DNA 在 35 個(gè)倍增循環(huán)后可以被擴(kuò)增形成數(shù)百萬(wàn)個(gè)拷貝。

  PCR 流程循環(huán)

  PCR 三個(gè)主要步驟的流程圖，包括 PCR 溫度循環(huán)、循環(huán)次數(shù)和總程序長(zhǎng)度

  該過(guò)程提供了由原始樣品分子的每條單鏈形成的新的雙鏈DNA分子副本。這個(gè)三步過(guò)程需要進(jìn)行 35 到 40 次，才能將 DNA/RNA 擴(kuò)增成數(shù)百萬(wàn)個(gè)重復(fù)片段。

  第 4 步 - 電泳分析

  一旦 PCR 過(guò)程完成，所產(chǎn)生的擴(kuò)增（復(fù)制）片段就可以與已知來(lái)源的其他核苷酸片段進(jìn)行比較。然后將 PCR 生成的核苷酸序列放置在分離凝膠中的人類(lèi)、病原體或其他來(lái)源的已知核苷酸序列旁邊。然后電流通過(guò)凝膠，凝膠內(nèi)的各種核苷酸序列根據(jù)其電荷和分子大小形成類(lèi)似梯子的帶。這稱(chēng)為凝膠電泳。在凝膠中遷移到相同水平的條帶或梯狀臺(tái)階顯示了核苷酸序列的同一性。這種方法是完成 PCR 測(cè)試最流行的方法之一。

  定量PCR

  qPCR 是傳統(tǒng) PCR 的一種變體，允許在通常的 40 個(gè)循環(huán)過(guò)程中使用熒光染料實(shí)時(shí)分析擴(kuò)增/復(fù)制的 DNA。熒光染料附著在一些核苷酸鏈上，允許用戶(hù)在擴(kuò)增/復(fù)制循環(huán)期間測(cè)量特定產(chǎn)物及其數(shù)量。qPCR 使用特殊的熱循環(huán)儀，稱(chēng)為實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀。除了加熱和冷卻裝有 PCR 試劑的管子外，他們還可以在每個(gè)循環(huán)中測(cè)量管內(nèi)的熒光。這使得用戶(hù)可以跳過(guò) PCR 產(chǎn)物最終分析所需的凝膠電泳或其他輔助程序，從而更快地產(chǎn)生結(jié)果。