PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)輕松上手：圖解詳解步驟，助您快速掌握

  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 有時(shí)稱為分子復(fù)印，傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 有時(shí)稱為分子復(fù)印，是一種用于放大（復(fù)制）樣品中痕量 DNA 和 RNA 的技術(shù)。PCR 熱循環(huán)儀用于生產(chǎn)研究所需的大量樣品。

  PCR 過程可用于多種實(shí)驗(yàn)室和臨床應(yīng)用和目的。法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室用它來分析犯罪現(xiàn)場的 DNA 樣本。臨床醫(yī)療保健實(shí)驗(yàn)室用它來診斷病毒感染的患者。制藥研究實(shí)驗(yàn)室使用它來分析和復(fù)制 DNA 和 RNA 樣本，用于藥物和疫苗的制造。

  PCR原理

  在PCR實(shí)驗(yàn)過程，需要四種成分（試劑或化學(xué)品）如下：

  DNA 或 RNA 樣本（來自唾液、血液、頭發(fā)、皮膚刮屑等）

  （1）、DNA 引物：促進(jìn)核苷酸互補(bǔ)鏈合成的短單鏈 DNA

   （2）、DNA聚合酶：一種有助于合成DNA互補(bǔ)鏈的酶

  （3）、含有腺嘌呤 (A)、胸苷 (T)、胞嘧啶 (C) 和鳥嘌呤 (G) 的核苷酸溶液混合物，用于構(gòu)建重復(fù)的 DNA 鏈

  原理分為四步走，如下：

  （1）變性：是利用DNA在體外高溫時(shí)變性，雙鏈解離變成單鏈；

  （2）退火：低溫時(shí)引物與單鏈DNA按堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合；

  （3）延伸：再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72℃左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5’- 3’)的方向合成互補(bǔ)鏈。

  將這3個(gè)步驟重復(fù)（“循環(huán)”）25-35次，即可按指數(shù)方式獲得精確的目標(biāo)DNA拷貝。

  PCR原理是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物原料，在引物引導(dǎo)的情況下，模板與底物通過DNA聚合酶的聚合延伸，多次重復(fù)后使DNA呈指數(shù)擴(kuò)增復(fù)制。

  PCR流程步驟

  PCR過程有 4 個(gè)步驟：收集、制備、擴(kuò)增和 PCR 后清理。PCR 機(jī)器步驟發(fā)生在擴(kuò)增步驟中。首先將一段 DNA 樣本與上面列出的試劑和化學(xué)品一起放入合適的試管中。將管放入PCR 機(jī)或熱循環(huán)儀中。熱循環(huán)儀通過 3 個(gè)步驟處理溶液：變性、退火和延伸。

  PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)步驟

  第 1 步 - 變性

  使用熱循環(huán)儀將管中包含的溶液加熱至至少 94°C (201.2°F)。熱量會破壞原始 DNA 樣品的氫鍵，并將 DNA 分離成單鏈（這稱為雙鏈 DNA 變性）。

  第 2 步 - 退火

  然后將樣品混合物冷卻至 50 至 60°C（122 至 140°F），使 DNA 引物和 DNA 聚合酶與通過加熱分離的各個(gè) DNA 鏈結(jié)合（這稱為 DNA 退火）引物）。此時(shí)，添加的混合物溶液中的核苷酸（A、T、C、G）將與加熱過程中產(chǎn)生的單獨(dú)的 DNA 鏈配對。

  第 3 步 - 擴(kuò)展

  一旦連接在一起，它們就會形成一條新的互補(bǔ) DNA 鏈（稱為 DNA 延伸）。因此，由原始樣品分子的每條單鏈形成了新的雙鏈DNA分子副本。溫度從 95°C 循環(huán)至 50 至 60°C。然后使用熱循環(huán)器重復(fù)該循環(huán)約 35 至 40 次，熱循環(huán)器自動重復(fù)該過程的加熱和冷卻循環(huán)。每次循環(huán)儀進(jìn)行加熱/冷卻循環(huán)時(shí)，所得 DNA 序列都會加倍。因此，最初來自一個(gè)樣本的一小段 DNA 在 35 個(gè)倍增循環(huán)后可以被擴(kuò)增形成數(shù)百萬個(gè)拷貝。

  PCR 流程循環(huán)

  PCR 三個(gè)主要步驟的流程圖，包括 PCR 溫度循環(huán)、循環(huán)次數(shù)和總程序長度

  該過程提供了由原始樣品分子的每條單鏈形成的新的雙鏈DNA分子副本。這個(gè)三步過程需要進(jìn)行 35 到 40 次，才能將 DNA/RNA 擴(kuò)增成數(shù)百萬個(gè)重復(fù)片段。

  第 4 步 - 電泳分析

  一旦 PCR 過程完成，所產(chǎn)生的擴(kuò)增（復(fù)制）片段就可以與已知來源的其他核苷酸片段進(jìn)行比較。然后將 PCR 生成的核苷酸序列放置在分離凝膠中的人類、病原體或其他來源的已知核苷酸序列旁邊。然后電流通過凝膠，凝膠內(nèi)的各種核苷酸序列根據(jù)其電荷和分子大小形成類似梯子的帶。這稱為凝膠電泳。在凝膠中遷移到相同水平的條帶或梯狀臺階顯示了核苷酸序列的同一性。這種方法是完成 PCR 測試最流行的方法之一。

  定量PCR

  qPCR 是傳統(tǒng) PCR 的一種變體，允許在通常的 40 個(gè)循環(huán)過程中使用熒光染料實(shí)時(shí)分析擴(kuò)增/復(fù)制的 DNA。熒光染料附著在一些核苷酸鏈上，允許用戶在擴(kuò)增/復(fù)制循環(huán)期間測量特定產(chǎn)物及其數(shù)量。qPCR 使用特殊的熱循環(huán)儀，稱為實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀。除了加熱和冷卻裝有 PCR 試劑的管子外，他們還可以在每個(gè)循環(huán)中測量管內(nèi)的熒光。這使得用戶可以跳過 PCR 產(chǎn)物最終分析所需的凝膠電泳或其他輔助程序，從而更快地產(chǎn)生結(jié)果。