聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：數(shù)字 PCR

  數(shù)字PCR(dPCR)是繼終點(diǎn)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)之后的第三代PCR。數(shù)字PCR具有高靈敏度、準(zhǔn)確性和絕對(duì)量化樣本中目標(biāo)DNA量的能力。這種高靈敏度可以檢測(cè)罕見(jiàn)突變、拷貝數(shù)變異(CNV)、低豐度轉(zhuǎn)錄本、罕見(jiàn)microRNA和極低病毒載量。

  什么是數(shù)字PCR（dPCR）

  數(shù)字PCR的概念最早由Sykes等人于1992年提出，他們認(rèn)識(shí)到，極限稀釋、終點(diǎn)PCR和泊松統(tǒng)計(jì)的組合可以產(chǎn)生核酸濃度的絕對(duì)測(cè)量值（Sykes等人，1992年）。隨后，約翰霍普金斯大學(xué)的Vogelstein和Kinzler開(kāi)發(fā)了一種方法，將樣本稀釋并分配到可以單獨(dú)擴(kuò)增單個(gè)模板分子的程度，每個(gè)分子都在單獨(dú)的分區(qū)中，并使用熒光探針檢測(cè)產(chǎn)物（Vogelstein和Kinzler，1999年）。“數(shù)字PCR”一詞就是為描述這種新方法而創(chuàng)造的。

  dPCR與標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)PCR的不同之處在于，樣本首先被隨機(jī)分成20,0000個(gè)子反應(yīng)，而不是在批量樣本上作為單個(gè)反應(yīng)運(yùn)行。PCR反應(yīng)在每個(gè)分區(qū)上進(jìn)行，可以是單個(gè)液滴，也可以是在微流體芯片上。理想情況下，每個(gè)分區(qū)將包含一個(gè)或零個(gè)目標(biāo)序列。為了補(bǔ)償包含多個(gè)目標(biāo)序列的少數(shù)分區(qū)，數(shù)據(jù)通過(guò)泊松統(tǒng)計(jì)處理。如果分區(qū)包含可擴(kuò)增序列，則將其計(jì)為陽(yáng)性（否則將其計(jì)為陰性）。

  假設(shè)每個(gè)分區(qū)只有一個(gè)目標(biāo)，則可以通過(guò)計(jì)算陽(yáng)性數(shù)并根據(jù)分區(qū)數(shù)和稀釋因子進(jìn)行推斷來(lái)絕對(duì)量化原始樣本中有多少個(gè)目標(biāo)。由于計(jì)算了實(shí)際目標(biāo)數(shù)，因此不需要校準(zhǔn)曲線，但建議對(duì)已知樣本和數(shù)量進(jìn)行控制，以幫助驗(yàn)證數(shù)據(jù)，尤其是為了發(fā)表。

  dPCR是如何工作

  1.樣品制備

  與任何基因組分析一樣，良好的樣品制備至關(guān)重要。dPCR可用于擴(kuò)增任何純化的DNA樣品（gDNA或cDNA），但與qPCR一樣，無(wú)法直接擴(kuò)增RNA。因此，在dPCR分析之前，必須分離任何感興趣的mRNA靶標(biāo)并將其轉(zhuǎn)化為cDNA。

  然后將純化的gDNA或cDNA與正向和反向引物以及水解探針混合，每個(gè)引物都設(shè)計(jì)為具有與目標(biāo)基因/目標(biāo)DNA互補(bǔ)的序列。與傳統(tǒng)PCR一樣，引物退火到目標(biāo)序列的3'和5'端（通常長(zhǎng)度為60-150bps）。此外，與傳統(tǒng)PCR不同的是，5'核酸酶（水解）探針隨后在正向和反向引物之間退火，并包括5'熒光團(tuán)和3'猝滅劑。水解探針增加了反應(yīng)的靈敏度。與所有PCR和qPCR一樣，引物和探針設(shè)計(jì)是獲得良好數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。

  2.稀釋和分配

  在樣品制備和添加引物和主混合物后，dPCR檢測(cè)將樣品混合物分成單獨(dú)的納升反應(yīng)，因此每個(gè)分區(qū)中有1個(gè)或0個(gè)目標(biāo)DNA分子。一些dPCR平臺(tái)將混合物分成單獨(dú)的微模塑料孔，而其他dPCR平臺(tái)將納升大小的反應(yīng)液滴創(chuàng)建為油/水乳液。然后，dPCR分析大約20,000個(gè)單獨(dú)的qPCR反應(yīng)。

  3.PCR擴(kuò)增和終點(diǎn)分析

  分割后，使用常規(guī)PCR循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)。隨著DNA聚合酶從正向引物延伸，其核酸外切酶活性會(huì)降解探針，從3′猝滅劑中釋放出5′熒光團(tuán)，進(jìn)而發(fā)出可檢測(cè)的熒光。如果檢測(cè)包括插入染料而不是水解探針，則熒光會(huì)隨著雙鏈PCR擴(kuò)增子的積累而增加。

  PCR循環(huán)完成后，任何包含一個(gè)模板或目標(biāo)DNA序列的分區(qū)都會(huì)發(fā)出熒光。帶有熒光的液滴或孔的總數(shù)代表樣品中的目標(biāo)分子總數(shù)。實(shí)驗(yàn)完成后，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)工具分析數(shù)據(jù)。

  數(shù)字PCR的應(yīng)用

  ddPCR系統(tǒng)中的樣本分割可實(shí)現(xiàn)單個(gè)模板分子的靈敏、特異性檢測(cè)和精確定量，同時(shí)減輕靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)的影響，使PCR擴(kuò)增對(duì)抑制的敏感性降低，并大大提高僅相差一個(gè)核苷酸的檢測(cè)的鑒別能力。與其他PCR方法相比，數(shù)字PCR具有顯著優(yōu)勢(shì)：絕對(duì)定量和大大增強(qiáng)的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍。由于其高靈敏度、精確度和絕對(duì)定量，數(shù)字PCR在許多應(yīng)用中將核酸分析的范圍擴(kuò)展到其他方法無(wú)法企及的范圍：

•   液體活檢
•   拷貝數(shù)變異(CNV)
•   稀有序列檢測(cè)
•   基因表達(dá)和miRNA分析
•   單細(xì)胞分析
•   細(xì)胞和基因治療中的污染物檢測(cè)
•   病原體檢測(cè)
•   下一代測(cè)序(NGS)文庫(kù)分析