科研實驗必備知識：一抗與二抗的區(qū)別

  一抗和二抗有什么區(qū)別？這是實驗室新手經常問的問題。這里我們將從結合能力、用途與標記、來源、克隆性、預吸附五個角度來回答這個問題。

  結合能力

  抗體 (Ab) 廣泛用于研究。根據(jù)其結合能力，抗體可分為兩類：一抗和二抗。具體來說，一抗是與蛋白質或抗原 (Ag) 或您研究的任何物質結合的抗體，而二抗是與一抗結合的抗體。看下圖1：

  圖 1 主要抗體 VS二抗體

  如果您讀過我們之前的文章什么是抗體？您將對抗體結構的良好了解，然后您會發(fā)現(xiàn)更容易理解一抗的 Fab 結構域與抗原結合并將其 Fc 結構域暴露給二抗，從而二抗的 Fab 結構域與一抗結合抗體的 Fc 結構域。

  由于給定物種中同類的所有抗體分子的 Fc 結構域都是相同的，因此一種類型的二抗能夠與多種類型的一抗結合。例如，當在小鼠中產生的IgG類抗體用作一抗時，可以使用靶向小鼠IgG Fc結構域且不在小鼠中產生的抗體作為二抗。

  用途

  在免疫測定中，總是需要一抗來與靶抗原結合，但不一定使用二抗。我們以直接ELISA和間接ELISA為例。直接ELISA涉及直接標記，即一抗直接用酶標記進行酶促反應和信號檢測，不需要二抗。間接ELISA不直接標記一抗，而是用酶標記二抗，如下圖2所示。

  圖 2 直接 ELISA 對比間接ELISA

  是否標記一抗（直接標記）或二抗（間接標記）取決于您的實驗。無論是直接標記還是間接標記都有其優(yōu)點和缺點。直接標記通常與簡單的方案相關，可以節(jié)省時間和試劑，沒有與二抗發(fā)生交叉反應的風險，但缺乏信號放大和靈活性，并可能導致高背景。間接標記涉及信號放大，由于同一二抗可以與多種一抗反應，因此非常靈活，但具有相對復雜的方案和交叉反應風險。

  來源

  抗體的來源是需要考慮的一個重要方面。一抗的宿主物種應與樣品的物種不同，以避免二抗與樣品免疫球蛋白發(fā)生交叉反應。此外，二抗的宿主物種應與一抗的宿主物種不同，因為二抗應針對一抗的物種。

  例如，如果您研究小鼠樣本，您將需要在小鼠以外的動物中產生的一抗，例如在兔子中產生的一抗。然后，如果您使用針對小鼠的兔抗體作為一抗，您將需要在兔以外的動物中產生的二抗，例如在山羊中產生的二抗。

  為了能夠檢測目標抗原，二抗不僅應當對一抗的種類具有特異性，而且還應當對一抗的同種型具有特異性。例如，如果一抗是在兔體內產生的 IgG1 抗體，您將需要可以與兔 IgG1 抗體反應且不是在兔體內產生的二抗。

  克隆性

  一抗可以是單克隆抗體 (mAb) 或多克隆抗體 (pAb)。

  我們首先比較一下單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體僅識別抗原上的一個表位，而多克隆抗體識別抗原上的多個表位。因此，單克隆抗體和多克隆抗體具有不同的性質和用途。單克隆抗體具有高特異性和高重現(xiàn)性，與多克隆抗體相比，染色背景更少。然而，由于其高特異性，當抗原的化學處理改變目標表位時，單克隆抗體可能無法發(fā)揮作用。相比之下，多克隆抗體具有高親和力，能夠耐受抗原的微小變化，并且可以進行更穩(wěn)健的檢測。但多克隆抗體具有較高的批次間變異性，并且更有可能通過染色產生高背景。

  如果您的實驗需要高特異性，使用單克隆抗體作為一抗可能是一個不錯的選擇。如果陽性信號較弱，請嘗試多克隆抗體。由于多克隆抗體可識別多個表位，因此它們更有可能在免疫沉淀 (IP) 和染色質免疫沉淀 (ChIP) 中提供更好的結果。但如果你想探測抗原的特定域，多克隆抗體就沒有用了，單克隆抗體作為一抗可能會更好。

  二抗可以是與一抗或其片段結合的單克隆抗體或多克隆抗體。二抗有不同形式。首先，二抗可以針對一抗的整個分子。例如，一抗通常是 IgG 同種型。然后，您需要抗 IgG H&L（重鏈和輕鏈）抗體作為二抗，它與 IgG 一抗的重鏈和輕鏈發(fā)生反應。此外，這種抗 IgG H&L 抗體還會與一抗物種的其他免疫球蛋白類別（例如 IgM 和 IgA）發(fā)生反應，因為給定物種中的所有免疫球蛋白都具有相同的輕鏈。其次，二抗可以對一抗的 Fab 區(qū)具有特異性。同樣，這種形式的二抗也與重鏈和輕鏈反應，因此與具有相同輕鏈的其他免疫球蛋白類別反應。第三，二抗可以對一抗的 Fc 區(qū)具有特異性，這意味著它僅與重鏈反應。因此，該二抗僅與一類免疫球蛋白發(fā)生反應，例如 IgG 或 IgM。最后，二抗可以對一抗的輕鏈具有特異性，因此它將與具有相同輕鏈的所有免疫球蛋白類別發(fā)生反應。關于單克隆和多克隆，可以參考這篇文章《蛋白質免疫測定：認識多克隆抗體和單克隆抗體》

  5、預吸附

  二抗有時需要額外的純化過程，稱為預吸附，以提高特異性并最大限度地減少非特異性。在預吸附過程中，含有二抗的溶液通過含有來自潛在交叉反應物種（例如樣品物種）的固定血清蛋白或免疫球蛋白的柱基質。通過這個過程，溶液中的非特異性抗體將被去除，而高度特異性的二抗被留下。例如，如果您使用小鼠組織，請選擇已吸附小鼠血清或小鼠 IgG 的二抗。

  預吸附的二抗產生較少的非特異性結合，因此不太可能產生非特異性背景。當您在多重標記實驗中測定蛋白質表達或研究富含免疫球蛋白的組織或細胞時，建議您使用預吸附二抗。

  綜上所述，一抗和二抗之間存在一些差異。首先，一抗和二抗具有不同的結合能力。一抗與檢測到的抗原結合，而二抗與一抗（通常是其 Fc 結構域）結合。其次，免疫分析中總是需要一抗，而二抗則不一定需要，這取決于實驗方法（直接或間接標記）。第三，產生的一抗的物種與樣品不是同一物種，產生的二抗的物種與一抗的物種來源不同。第四，一抗和二抗都可以是單克隆或多克隆，但克隆性的選擇需要考慮不同的因素。最后，二抗有時需要預吸附，而一抗一般不需要。

  現(xiàn)在，您可能會更好地了解一抗和二抗之間的差異，并會發(fā)現(xiàn)更容易為您的實驗選擇正確的抗體。選擇正確的抗體從來都不是一件容易的事。如果您選擇的抗體不適合您的實驗，您可能會浪費金錢、時間和寶貴的樣品。如果您對一抗和二抗還有疑問，歡迎前來咨詢。