免疫檢測是一類基于抗體-抗原特異性結(jié)合的生物化學(xué)和生物分析技術(shù)，用于定性和定量檢測各種生物樣品（例如溶液、細(xì)胞裂解物、組織、血液等）中特定靶標(biāo)分子的存在和濃度。這些靶標(biāo)分子主要為蛋白質(zhì)，但也包括與載體蛋白結(jié)合的小分子物質(zhì)，例如激素、藥物和毒素。ELISA和蛋白質(zhì)印跡法就是用于檢測蛋白質(zhì)配體的存在和濃度的技術(shù)。本文將為大家介紹ELISA和Western-blot同為檢測樣品中的特定蛋白質(zhì)的手段，有何異同。
1.
什么是酶聯(lián)免疫吸附實驗
2.
什么是蛋白質(zhì)印跡法
3.
ELISA與WesternBlot區(qū)別
4.
常見問題解答
一、酶聯(lián)免疫吸附法實驗
ELISA是酶聯(lián)免疫吸附實驗縮寫，是免疫檢測的黃金標(biāo)準(zhǔn)，創(chuàng)始人是由由EvaEngvall和PeterPerlmann于1971年首次提出。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是一種廣泛應(yīng)用于生物分子檢測的免疫學(xué)技術(shù)，以其操作相對簡單、靈敏度高和可進(jìn)行一定程度的并行檢測而受到科研領(lǐng)域的歡迎。ELISA可用于檢測和定量各種生物分子，包括激素、糖蛋白、蛋白質(zhì)、抗體和抗原等。其基本原理是利用抗原與抗體之間的特異性相互作用來識別和定量目標(biāo)分子。
圖1 elisa夾心法原理圖
ELISA的具體操作步驟會根據(jù)不同的實驗設(shè)計而有所差異，但通常包括以下幾個關(guān)鍵步驟：
a、包被:將捕獲抗體或抗原包被在聚苯乙烯微孔板上。
b、封閉:用無關(guān)蛋白封閉板上的非特異性結(jié)合位點。
c、加樣:加入待測樣本，使目標(biāo)分子與包被的抗體或抗原結(jié)合。
d、洗滌:洗去未結(jié)合的物質(zhì)。
e、結(jié)合檢測抗體:加入酶標(biāo)檢測抗體，與目標(biāo)分子結(jié)合。(根據(jù)ELISA類型，這一步可能與步驟3合并)
f、洗滌:洗去未結(jié)合的檢測抗體。
g、添加底物:加入酶的底物，酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生可檢測的信號，例如顏色變化或發(fā)光。
h、信號檢測:使用酶標(biāo)儀讀取信號強(qiáng)度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算目標(biāo)分子的濃度。
ELISA的類型多種多樣，包括直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA和競爭ELISA，每種類型都有其特定的應(yīng)用場景和優(yōu)缺點。雖然ELISA具有諸多優(yōu)勢，但也存在一些局限性，例如可能受到樣本基質(zhì)效應(yīng)的影響，以及某些情況下特異性不夠高等。
二、蛋白質(zhì)印跡法
蛋白質(zhì)印跡法是一種廣泛使用的分析技術(shù)，用于從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中檢測和分析特定蛋白質(zhì)。它主要包括3個步驟：在凝膠上分離蛋白質(zhì)、將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體膜上以及通過使用一抗和二抗標(biāo)記蛋白質(zhì)來可視化蛋白質(zhì)。
圖2 化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡檢測示意圖
蛋白質(zhì)印跡法技術(shù)由HarryTowbin于1979年首次描述，并由W.NealBurnette于1981年命名。蛋白質(zhì)印跡法步驟如下：
a、凝膠電泳：使用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品。此步驟通常使用SDS-PAGE。
b、轉(zhuǎn)移：分離的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到固體支持物上，如硝酸纖維素或聚偏二氟乙烯膜。
c、總蛋白染色：使用諸如PonceauS、CoomasieR-350或酰胺黑等染料對膜進(jìn)行染色，從而使轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白質(zhì)可視化。
d、阻斷：此步驟是為了阻斷膜與下一步將應(yīng)用的抗體之間的相互作用。由于目標(biāo)分子和抗體都是蛋白質(zhì)，因此膜有可能與抗體相互作用。
e、孵育：在膜上檢測帶有報告酶的抗體。在膜表面涂上針對該酶的特異性底物。如果發(fā)生結(jié)合，就會產(chǎn)生比色反應(yīng)。
f、檢測和可視化：未結(jié)合的探針被洗掉，凝膠中可見結(jié)合的蛋白質(zhì)。
ELISA與WesternBlot區(qū)別
酶聯(lián)免疫吸附實驗
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蛋白質(zhì)印跡法
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定義
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ELISA 是一種免疫吸附試驗，用于檢測樣本中的抗體或抗原。
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蛋白質(zhì)印跡法是一種用于從混合物中分離和識別蛋白質(zhì)的分析技術(shù)。
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定量
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定性和定量
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定性和半定量
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凝膠電泳
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不需要凝膠電泳步驟
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需要凝膠電泳步驟
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成本
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較低
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較高
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常見問題
問題1、檢測樣本蛋白質(zhì)，可以用ELISA代替WesternBlot嗎？
ELISA可以代替蛋白質(zhì)印跡法，因為它是一種更靈敏的方法。但蛋白質(zhì)印跡法能給出更具體、更準(zhǔn)確的結(jié)果。
問題2、ELISA是定性還是定量檢測？
Elisa可以提供定性，也可以提供定量檢測
問題3、ELISA和Westernblot哪個更準(zhǔn)確？
通常使用蛋白質(zhì)印跡法來確認(rèn)ELISA的結(jié)果。兩種技術(shù)的結(jié)果準(zhǔn)確率均為99.9%。
問題4、elisa檢測有哪些優(yōu)勢？
Elisa檢測成本相對較低，其次是操作簡單，具有高特異性和靈敏度。
問題5、與ELISA相比，Westernblot有何優(yōu)勢？
與ELISA相比，Westernblot的一個優(yōu)勢是它是一種高度特異性的技術(shù)。用于轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的硝酸纖維素膜具有很高的蛋白質(zhì)結(jié)合能力和化學(xué)穩(wěn)定性。
上述是ELISA和Westernblot介紹，相信你對兩者之間的區(qū)別有所了解。如果實驗是為了驗證基因表達(dá)、蛋白質(zhì)修飾分析和蛋白質(zhì)純化監(jiān)測等比較推薦Westernblot。
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